1、影响胚乳培养效果的因素

胚乳培养主要有带胚培养和不带胚培养两种方式，一般情况下带胚培养比不带胚培养的更容易诱导形成愈伤组织。胚乳培养的一般过程与胚培养的过程大致相同，首先是选择适宜发育时期的胚乳作为外植体进行培养，筛选合适的培养基和培养条件。胚乳培养的过程中，能直接从胚乳组织分化出器官的植物很少，大都是先形成愈伤组织，然后在分化培养基上进行胚状体或不定芽的分化。胚乳培养具有较大的难度，主要受到材料的基因型、胚乳的发育时期和类型、培养基和培养条件等因素的影响。

(一)基因型

越来越多的研究表明，供体植株的基因型是影响胚乳培养的关键因素之一，不同基因型的胚乳对培养基的反应不同，对营养成分和培养条件的要求也有所不同。表现在胚乳培养力，如愈伤组织诱导率和分化率、胚状体诱导率及植株诱导率等的差异上，不同材料对同一种培养基反应差异较大，有的材料甚至对培养基没有反应。例如，在猕猴桃属中，不同种之间的愈伤组织诱导率在相同培养基上存在明显差异，硬毛猕猴桃愈伤组织的诱导率为87.9％，而中华猕猴桃为56％。

(二)胚乳的发育时期和类型

胚乳是由受精极核(初生胚乳核)分裂开始发育的，首先形成游离的胚乳核(游离核型期)，然后发育产生细胞壁，形成许多小的细胞(细胞型期)。按时间可分为早期、旺盛生长期和成熟期。接种时胚乳的发育时期与愈伤组织的发生及其频率有密切关系。无论是核型胚乳还是细胞型胚乳，处于发育早期的胚乳，不但接种操作不方便，而且诱导愈伤组织的频率很低。例如，红江橙(Citrus L.)发育前期胚乳的愈伤组织诱导率低于发育后期；青果期的枸杞(Lycium chinense)胚乳愈伤组织诱导频率显著低于变色期和红果期。游离核或刚转入细胞期的核型胚乳很难诱导愈伤组织。一般情况下，处于旺盛生长期的胚乳，在进行离体培养诱导愈伤组织时，诱导效率最高。处于生长旺盛期苹果胚乳的愈伤组织的诱导率可以达到90％。因此，胚乳旺盛生长期是取材的最佳时期。根据这一特点，水稻的最佳取材时期在授粉后5～7d，玉米和小麦在授粉后8～12d，大麦在授粉后10～20d，黑麦草和黄瓜在授粉后7～l0d，小黑麦在授粉后7～14d。但接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低，甚至不能产生愈伤组织。例如，种子发育中后期的苹果胚乳，愈伤组织诱导频率不超过5％。接近成熟的葡萄胚乳几乎不能产生愈伤组织。完全成熟的猕猴桃种间杂种胚乳，在离体条件下不能生长和增殖。授粉后超过12d的玉米和小麦胚乳、授粉后21d的小黑麦胚乳，产生愈伤组织的能力极低。水稻以及一些大戟科、桑寄生科和檀香科植物是例外，它们的成熟胚乳表现出较高的愈伤组织诱导频率和一定的器官分化能力，甚至能产生完整的再生植株。

(三)基本培养基

选择合适的基本培养基是胚乳培养的重要环节。在胚乳培养中，常用的基本培养基有White,B5,LS,MS和MT等，其中MS基本培养基使用频率最高。此外，为了促进愈伤组织的产生和增殖，在培养基中经常添加一些有机物，如水解酪蛋白或酵母浸提物等。据报道，进行小麦、变叶木(Codiaeum variegatum)和葡萄的胚乳培养时，在培养基中添加一定数量的椰子汁有助于愈伤组织的诱导和生长。Larue (1949)培养玉米胚乳时，在培养基中尝试添加了很多种补充成分，如番茄汁、葡萄汁、青玉米汁、酵母提取物或牛奶等，其中含20％番茄汁的培养基效果最好。随后的研究表明，酵母提取物可以在很大程度上取代番茄汁的作用，也能促进黑麦草胚乳愈伤组织的生长。Straus (1960)发现一定量天冬酰胺的作用比番茄汁或酵母浸出液的效果更好。有机添加物对胚乳愈伤组织茎芽分化的效果因植物种类而异。例如，水解酪蛋白对罗氏核实木愈伤组织分化是必不可少的，但对于枸杞的胚乳愈伤组织分化具有抑制作用。

胚乳培养可使用蔗糖作为碳源，研究表明，2％～4％的蔗糖对玉米和蓖麻胚乳愈伤组织生长的效果最好，8％的蔗糖有利于小黑麦愈伤组织的形成。阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和乳糖等则表现出抑制作用。

不同植物种类胚乳培养的最适pH有一定的差异，因植物类型而异。例如，玉米的最适pH为6.1～7.0，核实木的最适pH为5.6，苹果的最适pH为6.0～6.2，麻风树(Jatro-pha pandurae fplia)的最适pH为5.2，巴婆(Asimina triloba)的最适pH为4.0，蓖麻(Ricinus communis)的最适pH为5.0。

(四)外源激素

不同植物愈伤组织的诱导，要求的激素种类和水平不同。Nakajima (1962)从实验中发现，必须在培养基中使用生长素、细胞分裂素、有机氮源(酵母提取物或水解酪蛋白)才能使黄瓜胚乳组织正常生长。越来越多的研究表明，除基本培养基和有机添加物外，植物激素对胚乳愈伤组织的诱导和生长起着十分关键的作用。大麦在有2,4-D存在的条件下才能产生愈伤组织，猕猴桃在有ZT的条件下效果最好，但荷叶芹(Petroselinum hortense)在没有任何激素的培养基上能形成愈伤组织。培养基中的激素种类及配比与胚乳愈伤组织的分化密切相关。水稻胚乳愈伤组织在含有KT(2.0mg/L)和IAA(4.0mg/L)的培养基上分化频率高于只含有单一生长素的培养基。枸杞胚乳愈伤组织在含有BA或BA+IAA的培养基上，茎芽分化频率达80％左右，但在含有ZT或ZT+NAA的培养基上不能分化。

另外，外源激素的种类和水平还对培养材料的倍性水平有明显影响。例如，对猕猴桃的胚乳培养，培养基中含有2,4-D或NAA时，产生的植株具有不同的倍数，前者中多数是三倍体，后者中多数不是三倍体。

(五)胚因子作用

胚因子(embryo factor)是指胚在萌发时产生的某种物质，这些物质有利于胚乳的培养。到目前为止，有关胚在胚乳培养中的作用还不明确，具体的作用成分也不完全清楚，不同实验的结果也不一致。总体来说，胚乳培养中是否有原位胚的参与，主要与接种时胚乳的生理状态和成熟度有关。未成熟胚乳，尤其是处于旺盛期的未成熟胚乳，很多植物的胚乳在诱导培养基上无需胚的参与就能形成愈伤组织。在采用成熟种子的胚乳进行培养时，由于这时整个种子的生理活动十分微弱，胚乳的生理活动更是几乎停止，在诱导其脱分化前，必须在原位胚的萌发帮助下才能使其活化。活化所需时间的长短因植物种类而异。有些植物，如番荔枝等成熟胚乳的活化需要原位胚的萌发和GA₃的协同作用。在进行枸杞、葡萄和桃等植物胚乳培养中，带胚的胚乳产生愈伤组织的频率比不带胚的要高。在进行桃的未成熟胚乳培养时，有胚存在的情况下，可以提高愈伤组织的诱导率35％左右。大戟科的成熟胚乳培养，最初的愈伤组织诱导需要胚的存在。

Bhojwani (1968)用巴豆、Srivastava (1971)用核实木和蓖麻为实验材料，将成熟胚乳组织在培养之前用不同浓度GA₃或IAA进行浸泡分别处理。发现用一定量GA₃浸泡过的核实木胚乳组织，在无胚的情况下，可形成愈伤组织并分化出绿色芽体，因此，赤霉素具有部分代替“胚因子”的作用。同时说明植物激素对胚乳的增殖和分化具有作用。

(六)培养条件

胚乳愈伤组织诱导和生长的最适温度为25℃左右，喜温植物略高，耐寒植物略低。光照条件因植物种类不同而异。例如，玉米胚乳培养适合暗培养，蓖麻胚乳培养需要连续光照条件。

二、植株再生途径

胚乳愈伤组织的分化和植株再生主要与植物的种类有关，总体来说，胚乳培养的器官分化和植株再生的难度要远高于对愈伤组织的诱导。胚乳培养诱导产生的愈伤组织的分化和植株再生一般有两种途径，即器官发生途径和胚状体发生途径。

(一)器官发生途径

在胚乳培养中，器官发生是一种较为常见的植株再生方式。John和Bhojwani(1965)在进行檀香科的柏形外果胚乳培养中发现了胚乳组织分化器官的现象。在含有IAA、激动素和水解酪蛋白的培养基上，有些种子的胚乳部位长出了芽。随后的研究中很多植物的胚乳组织分化出了芽，而且有些获得了再生植株。在被子植物胚乳培养中，最先出现器官分化的是大戟科植物巴豆和麻疯树，前者分化出根，后者分化出三倍体的根和芽，但均未能进一步形成正常的植株。之后，在罗氏核实木、苹果、梨等植物的成熟胚乳愈伤组织上也先后分化出芽，并形成了三倍体的再生植株。单子叶植物中，Nakan。等最早报道水稻未成熟胚乳愈伤组织在含有IAA的培养基上分化出茎芽，但未得到植株。到目前为止，胚乳愈伤组织通过器官发生途径再生成完整植株的物种有10余种，其中包括苹果、梨、枇杷、马铃薯、枸杞、水稻、玉米、大麦、罗氏核实木、黄苓、石刁柏、猕猴桃和杜仲等。

(二)胚胎发生途径

胚乳愈伤组织通过胚胎发生途径再生植株也与培养基中的激素类型、配比有关，在多数情况下，并不是一种培养基能同时诱导胚状体和再生植株。王大元(1978)进行柑橘胚乳培养时，采用MT+1.0mg/L GA₃的培养基，分化出球形胚状体，但在同一培养基上不能进一步发育，只有在无机盐浓度加倍，并逐渐提高GA₃浓度的情况下，才能通过以后各个发育阶段。甜橙也需要通过类似方法才能获得胚乳再生植株。Lakshmi (1980)进行檀香(Santalum album)胚乳愈伤组织培养时，在MS+GA₃ (1～2mg/L)培养基上可形成胚状体并能逐步发育成熟，但只有降低培养基中无机盐浓度，胚状体才能成苗；枣的胚乳胚状体成苗也有类似要求。由此可见，为了促进胚状体的发育和成苗，需对培养基中的激素种类和水平进行调节，有时还需调节培养基中无机盐浓度。

在胚乳培养中，2,4-D对多数植物胚状体的发生有明显的诱导作用，但对胚状体的发育和萌发又有抑制作用。GA₃对胚状体的发育和成苗具有重要作用。此外，核桃和枣的胚状体在成苗之前必须通过一段低温休眠期。

(三)再生植株的染色体倍性变异

研究表明，在植物体内胚乳细胞常常出现高度的多倍化和各种不规则的有丝分裂现象。例如，核型胚乳在游离核发育时期常常发生无丝分裂、核融合及异常有丝分裂等现象，产生的愈伤组织往往是多种倍性细胞及非整倍体细胞的嵌合体。在进行胚乳培养的过程中也发现同样的现象。Straus (1954)研究发现，在玉米的胚乳培养中，多倍体、亚倍体和非整倍体普遍存在。

胚乳再生植株染色体不稳定性的原因可能有以下几个。①胚乳细胞本身：用做外植体的胚乳组织本身就是一个多种倍性细胞的嵌合体，由此产生的愈伤组织和再生植株不可能只是三倍体。②胚乳愈伤组织发生部位：不同部位的胚乳细胞染色体组成情况有所不同。例如，苹果合点端胚乳的各种异常有丝分裂及无丝分裂现象比珠孔端更为普遍。③外源激素诱导：研究表明，某些外源激素可以诱导细胞产生染色体数目和结构的变异。例如，称猴桃胚乳在含有ZT (3.0mg/L)和IAA (0.5mg/L)的培养基上再生的植株大多不是三倍体，而在ZT(3.0mg/L)和2,4-D(1.0mg/L)的培养基上，产生的再生植株多数是三倍体。

胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数目常常发生变化。苹果(2n=34)胚乳植株染色体数为29～56，其中大多数为37～56，真正的三倍体细胞只占所有细胞的2％～3％;枸杞、梨、玉米和大麦等胚乳植株的染色体数也不稳定。此外，胚乳再生植株常出现同一植株不同倍性细胞的嵌合体。因此，必须对胚乳再生植株做细胞遗传学的鉴定，以确定其染色体数目和倍性。