基因枪法，又称为生物弹法、微粒枪法或微粒轰击法，是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。基因枪法是继农杆菌介导法之后又一应用较广的遗传转化技术。

最早是由美国康奈尔大学的Sanford等在1987年研制出火药引爆的基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究基因转移的新方法。自Christou等(1991)利用此项技术获得成功以来，利用基因枪已相继成功地转化了水稻、小麦、玉米、大豆、棉花等重要的粮食作物和经济作物，并获得了相应的转基因植株。基因枪法技术具有以下特点：①无宿主限制；②靶受体类型十分广泛，几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞；③有特殊的应用，可将外源DNA转入线粒体、叶绿体，也可用于花粉转化、作图法基因克隆、启动子研究、与根癌农杆菌协同转化等；④基因枪法转化频率低、嵌合体较多、结果的重复性差且转化的外源基因以多拷贝居多而易导致基因沉默；⑤遗传稳定性差，实验成本较高。

一、基因枪在植物遗传转化中的应用

Klein等(1987)首次以洋葱表皮细胞为材料，以钨粉为子弹，把DNA, RNA导入细胞，且观察到外源基因能表达，并发表了第一篇有关基因枪介导转化的文章，证明此方法是可行的。1988年，McCabe等用外源DNA包被的钨粒对大豆茎尖分生组织进行轰击，结果约有2％的组织通过器官发生途径获得再生植株，并且在R₀、R₁代植株中检测到了外源基因的表达。1990年以前，农杆菌介导法转化还不能在单子叶植物的遗传转化中使用，因此用基因枪法将外源DNA送入完整细胞成为单子叶植物遗传转化的主要手段。1988年Wang等采用基因枪法成功转化水稻悬浮细胞以来，一系列受体材料的含不同外源基因的转基因工程水稻相继问世。1990年Goedon-Kamm用基因枪法将GUS报告基因和CAT选择性基因导入玉米悬浮细胞系，且再生的转基因玉米植株能够结实，首次获得转基因玉米。1993年Koziel等用基因枪将Bt基因导入一个优良玉米自交系的幼胚中。转基囚植株能高水平表达CrylA(b)，在温室和大田栽培中表现出很强的抗玉米螟的能力，且在后代中稳定遗传。1994年，Rasmussen等用质粒PBC-17或PBAR-GUS转化的完整大肠杆菌DH5 α-F和用质粒PNY转化的根瘤农杆菌A208作为微弹转化玉米细胞，用飞盘型氦动力基因枪轰击，每次得到数个瞬间转化体、6个稳定转化体。1996年SacK等将细菌的淀粉液化酶基因转入玉米，不仅促进玉米合成具有较高经济价值的果聚糖，而且有助于研究玉米种子中蔗糖代谢和淀粉合成途径，显示出玉米遗传转化应用于农业生产的巨大潜力。1991年Christon等以水稻的幼胚为材料用基因枪法获得了转基因水稻。在此之后，Cao等(1992)和Li等(1993)对水稻的基因枪转化系统作了进一步改进，提高了转化频率。

小麦是世界上栽培面积最大的重要粮食作物。然而小麦却是最后一个获得转化成功的重要禾谷类作物。1992年Vasi1等首次报道，将GUS基因和抗除草剂基因通过基因枪法导入长期培养过的小麦胚性愈伤组织中。1993年Vasi1用基因枪法直接轰击幼胚、获得可育的转基因小麦株系，效率比轰击愈伤组织要高，转化率超过1％。 1993年Troy等也报道，通过基因枪法轰击愈伤组织获得可育的转报告基因的小麦植株。14次独立实验平均转化率为0.1％～0.2％。Becker及Nehra等分别报道，通过基因枪法轰击幼胚盾片组织获得转报告基因的小麦植株。国内，1997年傅荣昭首次报道用基因枪法直接轰击小麦幼胚，将雄性不育基因TA29-Barnase导入小麦品种‘豫麦18号’，获得了经Southern杂交证实的转基因小麦植株。此外国内还有一些报道不再列举。

基因枪除了应用于植物基因转化和外源基因导入植物细胞的细胞器外，还被应用于种质转化(germ line transformation)。所谓种质系(germ line)就是合子胚中特定细胞将来分化发育成植物体的特定器官和部位，这种预定的胚胎发育系统也称为细胞种系(cell line),目前研究最清楚的有玉米、拟南芥等植物。植物的种质系统包括茎尖分生组织、配子体及胚胎细胞。它们均可能作为外植体而被转化。1992年贾士荣等采用中国科学院生物物理所生产的JQ-700型高速基因枪，把pB1121质粒DNA轰击转化到玉米花粉和谷子花粉中，再进行人工授粉。1989年Twell等用基因枪把pLAT52-7质粒(CaMV35S /GUS)轰击转化到烟草花粉，获得GUS基因的表达，但外源DNA没有传给子代。

基因枪转化植物有其优点，但作为遗传转化的有效手段，其转化频率还有待提高。这里的转化频率是指再生出转基因植株的受体数与轰击受体数的百分比。水稻的转化频率一般不到10％，因此有必要对基因枪法进行优化。影响基因枪转化的因素较多，如轰击受体的材料和生理状态、外源基因的纯度和浓度、质粒的构建、微弹的材料、轰击次数等，找到这些因素的最佳组合将有助于转化效率的提高。当然，这项工作的完成需要大量实验数据和计算机分析系统的结合。

外源DNA整合到植物染色体上是随机进行的，因此，它们可能会产生不同的转基因拷贝数，得到不同的基因表达盒。这反过来会影响基因的表达。在对单子叶和双子叶植物的研究中表明，农杆菌介导转化法的转基因植株的转基因拷贝数相对少一些(平均为2.1和2.3)，而基因枪法转化产生的转基因植株的转基因拷贝数相对多一些(平均为4.2和5. 6)。并且农杆菌介导转化法的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率低于由基因枪法转化产生的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率—农杆菌介导转化法的DNA重排概率为0.07和0.106，基因枪法转化的DNA重排概率为0.57和0.66。

二、基因枪转化法的具体技术(以小麦幼胚的基因枪转化为例)

基因枪转化法的具体过程如图10-4所示。小麦幼胚的基因枪转化程序可包括如下步骤。

(一)无菌材料的获得和培养

取大田小麦开花后14～18d的麦穗，剥出幼嫩种子，用0.1％升汞灭菌10min，于超净工作台上挑出幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基MS2(MS+2,4-D mg/L+ ABA0.5mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖3％)上，25℃ ,暗培养。14d后将产生的淡黄色新鲜愈伤组织在转化前4～6h进行渗透处理，渗透培养基为MS2～0.2mg/L甘露醇+0.2mg/L山梨醇。轰击材料集中置于培养皿(直径9cm)中心不大于3 cm的范围内，25℃，暗培养。

(二)质粒及其制备

质粒的制备采用碱裂解法，经PEG纯化，保存于-20℃备用。

(三)基因枪转化

试验所用基因枪型号为PDS-1000/He System(美国Bio-Rad公司)(基因枪型号多种，均带有各自的参数)。按
轰击参数进行转化：金粉直径为1 um，包裹子弹的沉淀剂用50uL 2.5mol/L Ca(N0₃)₂+20uL 40％ PEG4000，每枪轰击的金粉用量为0.25ug DNA/125ug金粉，可裂圆片压力为1350psi①)，轰击距离为12 cm，每皿轰击一次。具体操作步骤见基因枪说明。

图10-4基因枪转基因示意图

(四)转化体的筛选和再生

轰击后的愈伤组织继续在渗透培养基中培养16h，然后转到原培养基MS2中过渡培养1～2周。用含有抗生素或除草剂的[如草胺膦(PPT)]继代培养基MSJ(MS+2,4-D 0.5mg/L+水解乳蛋白500mg/L+维生素B1 0.5mg/L+KCI 1000mg/L＋谷氨酰胺200mg/L＋蔗糖3％)筛选2次或3次，每14d继代一次。筛选后的愈伤组织转入附加PPT 5mg/L的培养基 MSK (MS+ KT0.5mg/L+ NAA0.2mg/L+蔗糖3％)中进行分化，每天光照16h, 1500～20001x, 23℃。待分化出的绿芽长至2～3cm高时，转至生根培养基MSI(MS+IBA 5mg/L+5％蔗糖)中，附加PPT10～30mg/L进行生根和筛选。

不同植物、不同组织的转化可查找相应的参考文献，结合自己建立的培养程序进行修改。

随着农杆菌介导法的研究深入，并不断的在不同科、属、种的转化技术的突破，基因枪轰击法转化技术的应用有所萎缩，但该法在基因亚细胞定位研究上的应用越来越得到重视，尤其是在基因瞬间表达上的研究。