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其他植物转基因技术(二)

发布时间:2017-11-27 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1356

一、超声波转化法

超声波具有较强的生物学效用,生物体对超声波作用的反应也是多方面的,这取决于超声波的频率、强度和作用时间,以及生物体的结构与功能状态。目前超声波在生命科学领域已得到广泛的应用和发展。利用超声波将外源基因导入受体细胞即是其中的一种。1990年,许宁等首次报道用此技术实现了植物基因转移,它不需要复杂昂贵的仪器设备,操作简便省时,转化率高,是一种比较理想的转基因方法。

(一)超声波的作用机制及转基因应用

超声波与媒质相互作用主要产生空化现象。所谓空化即在流体动力学中有相当大的破坏应力的作用下,液体内形成空泡的现象。在水中当超声波辐射面上的强度达0.3W/cm2时就会产生空化。空化泡大小可达几个微米,在一瞬间很快闭合,闭合时产生几千个大气压的球形冲击波。液体中存在气体则较易发生空化现象,即在相对较小的压力下便会产生液体裂隙。根据空化泡的变化,空化现象又可分为瞬态空化与稳态空化。瞬态空化是短暂而剧烈的,空化泡迅速胀大并破裂,破裂时发出高压冲击波和高温。稳态空化是指空化泡的大小变化是有规律和缓和的。在较高声强下较易导致空化泡的破裂,发生瞬态空化。然而这两种空化现象在超声波处理时几乎同时存在。

空化泡破裂时发出的冲击波能引起空化泡周围物质的机械破坏作用,同时也引起围绕小泡的液体物质的剧烈流动,即微声流现象的发生。低速微声流可使空化泡周围的物质混匀,然而高速的微声流能对周围物质产生剪切作用,足以破坏大分子以至于细胞。

已报道超声波可用于转化植物原生质体、植物悬浮细胞、植物组织块、小麦幼胚及动物细胞。转化过程比较简单,将待转化的无菌生物体与质粒DNA加入到有超声波缓冲液的容器中(如一小离心管),迅速混匀后将超声波发生器变幅杆末端插入液面下3~10mm,采用不同的声频、声强及时间进行处理。超声波可采用连续和脉冲两种方式。处理后的生物细胞转到新鲜的培养基上培养,即可长出转化了的生物体。超声波发生器可采用普通的超声波匀浆器。

超声波被用来辅助提高农杆菌对植物的转化效率,并在一些植物上取得了成功。农杆菌转染时将转化材料浸在农杆菌悬液中,再用超声波处理可提高转化频率,这可能是由于在目标材料的表层和深层超声波的空化效应过程中气泡闭合形成瞬间高压,连续不断的高压像一连串小“爆炸”不断地冲击材料表面,造成许多微损伤,从而明显提高了农杆菌的感染效率。

(二)超声波转化技术(以烟草的超声波转化为例)

1.植物材料

白肋烟(Nicotiana tabacum var. White Burley)无菌试管苗生长在14h光照/10h黑暗的培养室中,光照强度为1500~2000Ix,昼夜温度分别为28℃和22℃。

2.超声处理

取无菌试管苗的中部展开叶片,切成4mm×8mm的小块,并在叶块上用针刺若干小孔,放入超声小室中。超声小室中预先加入含5%二甲基亚砜(DMSO)的缓冲液3mL、转化质粒DNA 2ug/mL及鲑鱼精DNA (salmon, Sigma) 40ug/mL,室温下以声强为0.5 W/cm2的脉冲式超声波处理30min。超声后叶块组织用不加DMSO的缓冲液洗涤3次,接种在MS无激素培养基(MSc)上,置于LPH-200-RDSCT生长箱中培养,光周期为16h光照/8h黑暗、光强3000~40001x,昼夜温度分别为(25±1)℃及(20±1)℃。

3.卡那霉素抗性选择

对照及经超声波处理的叶片培养3d后转移至附加卡那霉素100mg/L的分化培养基上进行抗性选择。分化培养基的组成是MS基本成分附加6-BA 1.0mg/L,α-萘乙酸0.1mg/L,pH5.8,用0.7%琼脂固化。再生的卡那霉素抗性芽转移至含卡那霉素100mg/L的培养基上诱导生根,培养物均于LPH-200-RDSCT生长箱中培养,培养条件同前述。

二、浸泡法

用外源DNA直接导入方式来培育新的农作物品种是20世纪70年代以来在我国创立的一个育种新途径。DNA浸泡法是继花粉管通道法之后出现的又一外源DNA直接导入方法。DNA浸泡法包括DNA浸种、DNA浸苗、DNA浸胚、DNA浸芽4种方法。浸泡法是一种简单、快速、方便的转化方法,现已有报道证明外源DNA可通过浸泡的方式进入到植物的分生组织细胞中,并在受体基因组中整合和表达。刘春林(1999)、阮颖等(1997)用外源DNA浸泡水稻种子,蒋建雄等(2000)将棉花DNA导入竺麻等都获得了变异植株。

水稻种子采用浸泡法获得了转基因植株。具体操作如下:先将灭菌种子用无菌水浸泡12h,然后分别转入培养皿中,皿中加浓度为120ug/mL的DNA溶液(溶解在TE中),液面刚好盖过种子。28℃浸泡48h后转到含30ug/mL的G418的琼脂上进行抗性筛选。

采用浸泡法将外源基因导入小麦成熟胚也是一种实用方法。将小麦成熟胚剥出浸泡在0. 1×SSC的缓冲液中,加入20%的二甲基亚砜,再加入质粒溶液。浸泡后,用无菌0.1×SSC冲洗,置于MS+2 , 4-D 1~1.5mg/L+KT 1mg/L培养基上培养7d,经筛选培养后,转到分化培养基中培养。

三、子房注射法

子房注射法是一种外源DNA直接转移技术,实际上是在分子水平上进行远缘杂交,可以直接将外源DNA导入受体。子房注射法较为简便,而且进行外源DNA导入的时间比采用花粉管通道的方法较为宽松。尽管采用子房注射法导入外源DNA,有的子房萎缩坏死,但终归还是能得到一些导入外源DNA用以实验研究。采用子房注射法将外源DNA直接注入子房中,保证了外源DNA进入受体材料,扩大遗传资源、创建新的抗病种质,在水稻、棉花、西瓜、黄瓜等多种作物上有成功报道。

四、低能离子束法

这种方法是由我国科学家创造的一种基因转移方法。余增亮等在研究低能离子束与细胞表面相互作用的过程中,发现离子束对细胞壁具有蚀刻作用,提出了离子束介导转基因的设想。在此基础上,世界上率先开始离子束介导外源基因转移的研究。国外从20世纪90年代起也开始进行低能重离子注入生物的诱变效应和育种研究,但仅日本在1997年开始离子束介导转基因研究。十多年来,离子束介导的遗传转化在水稻、小麦、棉花、烟草、西瓜等多种作物上都取得了成功。

余增亮等进行了离子束对生物样品的刻蚀作用的研究,结果表明离子束对大豆子叶细胞表面会产生溅射现象,扫描电镜显示子叶表面有辐照损伤和离子刻蚀,并提出将离子束应用于转基因的可能性。人们进一步研究发现离子束对生物样品的刻蚀程度与注入离子的能量和剂量等密切相关。注入离子能量、剂量增加,引起刻蚀程度的加深,有利于形成微通道,便于外源基因进入受体细胞。因此发展了离子束介导遗传转化,其原理是:①一定能量和剂量的离子束对植物细胞壁的溅射作用破坏细胞壁和细胞膜的结构,结果在局部产生刻蚀和穿孔,为外源遗传物质进入细胞提供微通道;②用于注入的荷电正离子降低了细胞表面的负电性,减弱了对带负电的外源DNA的静电斥力,从而促进了外源DNA的吸附和进入;③离子束的直接和间接作用打断了细胞内的染色体DNA结构,有利于将外源遗传物质整合到受休基因组中。

五、显微注射法

显微注射法是Pena等在1987年首创,在用此方法进行基因导入时,通常需要先把原生质体或培养的细胞固定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口再进行操作。

微注射法是使用毛细微管(一般针尖的直径为0.5 nm)在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞或原生质体的一种直接而完善的方法。这种方法首先在动物细胞的转基因中使用,由于植物细胞的细胞壁和原生质体具有弹性,此法得到了一些改进,即将细胞用琼脂糖多聚赖氨酸固定,也可用吸管吸取单个细胞固定。一般原生质体都有一个非常大的液泡,液泡膜很薄,注射操作时容易使其破碎,这样就会改变胞质的环境pH,一些有毒物质会使胞质酶失活而引起细胞的死亡。因此在微注射时最好避开液泡,甚至可以用一定的方法去除液泡,也可以在细胞分裂中期将外源DNA注射到细胞中期板上。

六、脂质体介导转化法

脂质体介导转化法是Dellaporta等于1981年创造的,原理如下:脂质体为人工构建的类脂(或胆固醇)与磷脂构成的小体,能跨膜转运,可将核酸包裹起来,免于核酸酶的作用而保持核酸的完整性(图10-5),最终将外源DNA导入到细胞中去。但该方法缺点是,在包装DNA时必须用短时间的超声处理,会使相当多的DNA断裂。同时,所用的材料必须使用具有全能性的原生质体作为受体细胞,并且转化效率较低,现在很少使用。该法主要用于动物的基因转化,在植物上此方法介导的基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。

脂质体介导转化法就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合,从而达到转基因的目的。一般脂质体法分4个步骤:原生质体分离和纯化、脂质体的制备、原生质体与脂质体的融合,以及转化体的培养、筛选和鉴定。

图10-5脂质体介导转化

七、病毒载体转化

病毒侵染植株后,其核酸分子可以进入植物细胞进行自我复制和蛋白质合成。正是由于这一特性,使人们在20世纪80年代初期开始研究将病毒作为植物基因转移载体的可能性(图10-6)。双链DNA病毒、单链DNA病毒和RNA病毒都可以把基因转移到完整的植物体或组织中,并得到表达。这种方法的基因转化效率比较高,但是它的安全性受到质疑,目前主要用于动物的基囚转移。80年代以来,许多新的基因工程技术,如反转录技术、体外转录技术等迅速发展,使得对RNA病毒的操作变为可能。人们可以把RNA反转录成cDNA,在体外转录生成侵染性RNA。 1984年,Ahlquist等将这一技术在雀麦草花叶病毒(brome mosaic virus, BMV)中率先进行研究,随后,Ahlquist等于1986年用‘BMV Russian'株系构建了两种载体,表达了氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。

植物病毒载体系统是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入到植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有三种:单链RNA植物病毒载体系统、单链DNA植物病毒载体系统和双链DNA植物病毒载体系统。

(一)单链RNA植物病毒载体系统

大约90%以上的植物病毒的遗传物质都是具有感染性的正链RNA。以单链RNA植物病毒作载体转化植物细胞的步骤是:首先,用反转录酶和DNA聚合酶将单链的病毒RNA合成双链的cDNA拷贝;然后,将其克隆到原核生物的质粒或黏粒(cosmid)载体上,通过常规的遗传操作和分子生物学的方法改造载体DNA,将外源基因插入到病毒的cDNA部分;最后,通过体外转录将带有外源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。

Koxiel和Siegal于1984年应用烟草脆裂病毒(TRV)首先发展了这种病毒载体系统。此后,研究得比较充分的是一种小型多组分的病毒—雀麦花叶病毒(BMV)。有报道将γ-干扰素克隆到BMV的RNA3的cDNA巾在体外转录,与其他基因组RNA共感染烟草原生质体,γ-干扰素的mRNA累积水平和表达水平都比用CaMV35S启动子的表达系统高5倍。

(二)单链DNA植物病毒载体系统

双粒病毒是一类单链DNA植物病毒,它的病毒颗粒一般成对存在,双粒病毒的基因组比较小,其分子为2.5~3. 5kb,而且主要由单链的环状DNA分子组成,也有少量的复制型双链DNA分子。双粒病毒成对的两个颗粒所包含的基因组可以不同,但只有当两种DNA混合时才具有感染性。这种二连基因组作为外源基因的载体具有的优越性为:如果病毒的复制基因只在一种DNA上,那么就可以在另一种DNA上插入外源基因而不影响基因组的复制。Ugaki等则用小麦矮缩病毒(WDV)的基因组为基础构建了穿梭质粒,其中有带CaMV35S启动子的GUS基因,将这个质粒转到玉米胚乳原生质体中,检测到了GUS基因6d的表达,且产率比转入到植物细胞的单拷贝非复制型质粒高12倍。

图10-6病毒载体遗传转化示意图

当然,发展双粒病毒载体系统也有缺陷,这些病毒的感染部位仅局限在植株的维管组织,而且大部分靠媒介昆虫传毒,不能机械转移接种;另外,这些病毒都是球形颗粒,插入外源DNA的片段不能太大。这些因素影响了双粒病毒载体系统的应用。

(三)双链DNA植物病毒载体系统

双链DNA病毒载体系统的研究和应用主要集中在花椰菜花叶病毒(CaMV)上。CaMV是它所属的病毒组的一个典型成员,它的基因组是双链环状的DNA,长度大约为8.0kb。虽然Camv本身可以作为承载小片段外源DNA的克隆载体,但由于在它的大多数限制性酶切位点中插入外源DNA都会导致病毒失去感染性,而且它不能包装具有大于原基因组300bp的重组体基因组。所以,按外源基因插入或取代的方法发展CaMV克隆载体有着难以克服的困难。近年来,关于CaMV载体系统的研究主要在两个方面:①由缺陷型的Camv病毒同辅助病毒组成互补的载体系统;②将CaMV的DNA整合到Ti质粒DNA中组成混合的载体系统。

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