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基于PCR和限制性酶切相结合的分子标记和DNA芯片技术的分子标记

发布时间:2017-11-28 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1892

(一)AFLP标记

AFLP标记是1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法,具有专利权。AFLP标记较其他分子标记有着明显的优越性,因此迅速传播开来,尽管它已受到专利保护,但世界上很多实验室都在努力探索,在自己的研究中应用AFLP技术。Zabeau和Vos不得不将其专利解密,并以论文形式正式发表。其基本原理是利用限制性内切核酸酶酶切基因组DNA产生不同长度片段,并通过选择性扩增来检测DNA的多态性。其基本步骤是:首先用能产生黏性末端的限制性内切核酸酶对基因组DNA进行酶切,然后在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”(adapter),用与接头互补的且3'端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3‘端严格配对的片段才能得到扩增,即选择特定的片段进行PCR扩增,再利用高分辨力的测序胶分开这些扩增产物(图12-13),扩增产物可用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并通过放射性方法、荧光法或银染染色法检测(图12-14)。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。

图12-13AFLP的基本步骤

AFLP反应中用两种限制性内切核酸酶进行酶切(双酶切),通常一种酶的识别位点(常见切点)是6个碱基,另一种是4个碱基(稀有切点),如EcoR Ⅰ和MseⅠ,双酶切后产生三种片段:两端都为EcoRⅠ切口;两端皆为MseⅠ切口;一端为EcoRⅠ切口,另一端为Mse Ⅰ切口。在AFLP反应中,EcoRⅠ-Mse Ⅰ片段扩增较MseⅠ-MseⅠ片段优先;而EcoRⅠ -EcoRⅠ片段太大,通常无法扩增。

AFLP接头是一种人工合成的双链DNA,一般长度为14~18个核苷酸,由核心顺序和内切核酸酶位点特异顺序两部分组成。目前商品出售的AFLP试剂盒中用得多是EcoR工接头和Mse Ⅰ接头。当然,接头与选择性内切核酸酶(如EcoRⅠ和MseⅠ)切口的结合是特异的,酶切和连接可在同一反应中进行。AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸,一般长度为18~20个核升酸,由核心顺序(core)、内切核酸酶位点特异顺序(ENZ )和选择性核苷酸顺序(EXT)三部分组成。AFLP引物除了含有能与接头及酶切位点相互补的序列外,其3‘端还添加有1~3个选择性碱基,从而达到选择性扩增的目的。选择性核苷酸数目的多少主要是由待测样品基因组大小决定的。理论上讲,每增加一个选择性碱基,将只扩增其中1/4的片段,两个引物上都有3个选择性碱基时,仅会获得双酶切末端片段的1/4096的片段。以番茄为例,番茄基因组大小为950Mb,双酶切后产生的EcoR Ⅰ -MseⅠ片段数约为475000条,采用都含有三个选择性碱基的引物扩增后,在凝胶上可获得约115个条带。

图12-14AFLP引物PstⅠ +TAG和Mse Ⅰ +CAA对重组自交系群体(BTx623和IS3620C)的扩增图谱(Menz et al.,2002)

在实验中,酶切片段经过两次连续的PCR扩增,第一次PCR扩增被称为预扩增反应,所用的AFLP引物只含有一个选择性碱基,预扩增片段是上述两种酶共同酶切的片段,选择两种酶共同酶切可以产生比较小的酶切片段,经过PCR反应扩增出的产物主要在1kb左右,范围可能为100~1500bp。预扩增反应条件与常规PCR反应条件大致相同。由于第一次扩增的选择扩增性能相对较差,大量的扩增产物在凝胶中往往形成连续的一片。通常预扩增反应的产物经过大量稀释后用做第二次扩增反应[即选择性扩增(selective amplifica-tion)]的模板。选择性扩增的反应条件与普通PCR有所不同,主要不同之处是复性温度,它是采用温度梯度PCR。其PCR开始于高温复性(一般采用65℃,比常规PCR反应的复性温度高10℃),以期获得最佳选择性;以后复性温度逐步降低,一直降到复性效果最好的温度(一般是56℃ ),然后保持在这个温度下复性,完成其余的PCR循环周期。选择性扩增反应所用的引物中,选择性碱基数目的多少是决定扩增产物特异性和数量多少的主要因子。作为商品出售的AFLP选择性扩增引物,如EcoR Ⅰ引物和Mse Ⅰ引物,都是含有3个选择性碱基的引物,按照这3个碱基排列顺序,共有8种组合,即形成8种EcoRⅠ引物和8种MseⅠ引物,这两类引物可以组成64种扩增组合。对不同作物基因组DNA而言,不同的引物组合扩增效果不同。酶切片段结合位点中能够与引物上的选择性碱基配对的,就被识别并用做模板而被选择性地扩增出来。一般用含有3个选择性碱基的引物对稀释的预扩增产物进行第二次PCR扩增后,扩增片段将会大幅度减少(约为预扩增产物的1/256。

该技术的独特之处在于,人工设计合成了限制性内切核酸酶的通用接头,可与接头序列配对的专用引物。AFLP利用双酶切可产生更好的扩增效果,在凝胶上产生适宜大小的适于分离的片段,不同的酶切组合及选择性碱基的数目和种类可灵活调整片段的数目,从而产生不同的AFLP指纹。其优点是信息量大。例如,在一次电泳凝胶上,通常可检测近百个不同长度的DNA片段。其缺点是对DNA质量要求比较高;步骤繁琐,条件优化难;很多标记不能定位在连锁图上,定位到染色体上的标记易出现染色体聚集现象。

(二)CAPS标记

CAPS技术又称为PCR-RFLP,它实质上是PCR技术与RFLP技术相结合的一种方法,所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。当SCAR或STS的特异扩增产物的电泳谱带不表现多态性时,可用限制性内切核酸酶对扩增产物进行酶切,然后通过电泳检测其多态性(图12-15) 。与RFLP技术一样,CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。

CAPS标记有以下几个优点:①引物与限制酶组合非常多,增加了揭示多态性的机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析;②在真核生物中, CAPS标记呈共显性,即可区分纯合基因型和杂合基因型;③所需DNA量极少;④结果稳定可靠;⑤操作简便、快捷。CAPS标记最成功的应用是构建了拟南芥遗传图谱。Konieczny等(1993)将RFLP探针两端测序,合成PCR引物,在拟南芥基因组DNA中进行扩增,之后用一系列4碱基识别序列的限制性内切核酸酶酶切扩增产物,产生了很多CAPS标记,只用了28个F2代植株,就将这些CAPS标记定位在各染色体上,并构建了遗传图谱。不过,CAPS标记需使用限制性内切核酸酶,这增加了研究成本,限制了该技术的广泛应用。

图12-15CAPS的基本步骤

四、基于DNA芯片技术的分子标记

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指不同个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异。就两个序列的比较而言,可指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等;就遗传群体而言,指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸且其出现频率大于1%(若出现频率低于1%,则视为点突变,是不可能作为标记的)。它又被称为第三代新型多态性标记。通常我们所说的SNP包括单碱基的转换、颠换。SNP可分为两种,一种是遍布在基因组非编码序列中的核苷酸变异;另一种是分布在基因编码序列中的SNP,这种基因编码区的功能性突变,又称为cSNP。从理论上来说,SNP是目前覆盖了基因组所有DNA多态性的唯一标记方法。目前,搜寻SNP最普遍的方法是将已定位的序列标记位点(STS)和表达序列标记(EST)进行再测序;此外,还可通过基于公共数据库的来自不同基因型的序列来寻找SNP。随着第三代测序技术的发展和重测序的应用,可进行大规模SNP的发掘。

SNP的特点有以下几点。①双等位型标记(biallelic marker):理论上,单碱基替换包括1个转换C\T(G\A)和3个颠换C\A(G\ T)、C\G (G\C), A\T (T\A),但它们的频率各不相等,其中转换和颠换之比为2:1,而且第三、第四种类型很少,几乎无法检出。②在DNA分子上分布不均匀:多在CpG位点上发生C\T转换,约占总SNP的25%,大多数的C是甲基化的,它能够自发脱氨基产生T;在转录序列中SNP的频率低于非转录序列中SNP的频率,而且转录区的SNP非同义突变的频率比其他突变类型的频率要低得多。③密度高:人类基因组中平均每1. 3kb就有一个SNP;在模式植物拟南芥中,已有多达37 344个SNP,在密度上达到了基因组“多态位点”数目的极限。④具有高的遗传稳定性:基于单核苷酸的突变,突变率为10-9,与SSR多态性相比,具有更高的遗传稳定性。SSSNP的检测和分析易实现自动化:由于是双等位型标记,只需+/一分析就可以确定,有利于发展自动化技术进行大规模的筛选或检测。

目前,发展了很多SNP的分型方法,如基因芯片、分子探针、荧光偏振、荧光共振、质谱和磁性颗粒分析等。比较经济有效的方法有以下几种。①限制性内切核酸酶酶切技术,该方法将包含SNP的PCR扩增产物进行酶切以揭示多态性,其多态性基础是SNP位于限制性内切核酸酶识别位点序列内。②单链构象多态性(single-strand composition polymor-phism, SSCP)电泳,包含SNP的PCR扩增产物经SSCP分析后,可产生多态性。SSCP的分析原理是单链DNA在凝胶中的迁移率除了与其长短有关外,更主要的是取决于DNA单链间所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链内部可以折叠形成具有一定空间结构的构象,这种构象由DNA单链的碱基排列顺序所决定,即便是相同长度的DNA单链都会因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的改变造成单链空间构象产生变化,引起单链在凝胶中电泳迁移率的差异,从而表现出多态性。③特异引物延伸法,该方法除了扩增SNP区域的通用引物之外,在SNP区域还设计了特异引物;特异引物只能与其中的一种碱基互补,因此,含错配碱基的序列只有一个扩增产物,否则有两个扩增产物。④高分辨熔解曲线(highresolution melting curve, HRM)分析,HRM技术是新发展出来的SNP分型技术,主要是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、G+C含量、GC分布等是不同的,因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品进行区分。⑤ DNA芯片技术,DNA芯片是由几百到几千个核苷酸片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上而组成的密集的分子排列。首先将不同样品的DNA标记不同的荧光探针,然后与芯片上的微阵列进行杂交,若它们与芯片上的寡核苷酸存在同源序列,则能杂交上并发出不同荧光,其荧光信号强度能被特别仪器扫描显微镜(如荧光扫描显微镜)检测到。此外,随着越来越多的基因组序列被公布,可通过重测序技术直接进行测序分型(genotyping by sequencing)。

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