基因定位一直是遗传学研究的重要范畴之一，基因定位与克隆是高密度分子图谱构建的重要应用目的，它对育种家的意义之大是不言而喻的。

在分离群体中表现为不连续性变异能够明确分组的性状称为质量性状。质量性状通常受一个或少数几个主基因控制，不易受环境的影响。许多重要性状，如抗病性、抗虫性、育性等表现为质量性状遗传的特点。这些性状受单基因或少数几个基因位点控制，一般表现为显隐性特点。然而，典型的质量性状其实并不很多，不少质量性状除了受少数主基因控制之外，还受到微效基因的影响，表现出数量性状的特点，使得有时无法明确地从表现型推断其基因型。特别是对那些虽然受少数主基因控制，但还受遗传背景、微效基因作用以及环境条件影响的性状，就更难通过遗传学上普通的方法进行鉴别。而利用分子标记技术来定位、鉴别质量性状基因，通过与目标性状紧密连锁的分子标记来选择，则要容易得多，特别是对一些易受环境条件影响的抗性基因和抗逆基因进行选择就相对简单得多。

目前，质量基因的定位研究主要利用近等基因系分析法和分离集团混合分析法等途径。

关于这两种途径在快速有效地寻找与质量性状基因紧密连锁的分子标记方面已有许多成功的报道。

一、近等基因系分析法

两个或多个形态上相似，遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的遗传材料，称为近等基因系(near isogenic line, NIL)。近等基因系的获得有多种方式，其中最常用的方式是通过将两个具有不同目标性状的品种杂交，再与亲本之一多次回交后筛选得到在目标性状上差异表现不同的品系。这样，品系间以及品系与轮回亲本间就构成了近等基因系。

在育种中，当某一优良品种缺少1个或2个优良性状时，常采用回交方法将该优良性状从外源种质中转移到优良品种中去。用于多次回交的亲本是目标性状的接受者，称为轮回亲本或受体亲本；只在第一次杂交时应用的亲本是目标性状的提供者，称为非轮回亲本或供体亲本。回交的结果，将不断提高回交后代中轮回亲本的遗传成分，不断减少供体亲本的遗传成分，使其后代向轮回亲本方向纯合，其回交过程一直持续到新培育的目标品系为止，在理论上除了含有目标性状基因的染色体区段外，其他与轮回亲本几乎相同，因此，改良的品系与轮回亲本间实际上构成了一对近等基因系。

由于独立遗传有多个目标基因，如果不进行选择，回交第n代时，轮回亲本基因组所占比例为[1-(1/2)ⁿ]^m。可以看出，目标基因m越多，则轮回亲本基因组恢复得越慢。另外，当供体亲本的目标性状基因与其附近的其他基因存在连锁时，则轮回亲本置换供体亲本基因的进程将要减缓，其减缓程度依连锁的紧密程度而异。由于基因连锁的结果，在回交导入目标基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将随之进入回交后代中，这种现象称为连锁累赘(linkage drag)。为了加快回交后代基因组恢复成轮回亲本的速度，在每一代选择继续回交的植株时，除了要保证含有供体目标基因外，应尽量选择形态上与轮回亲本接近的植株。由上可知，要培育遗传背景纯一的近等基因系往往需要多个世代的选择和繁殖。

最早由Young等提出来的近等基因系分析法，是利用近等基因系寻找与目标基因紧密连锁的分子标记。如果近等基因系间存在目标性状的显著差异且发现存在多态性的分子标记，则该标记就可能位于控制目标性状基因的附近。这样可在不需要完整遗传图谱的情况下，先用两个近等基因系筛选分子标记，再用近等基因系间的杂交分离后代进行标记与性状的连锁距离的进一步分析，有效地筛选与目标基因连锁的分子标记。

利用NIL寻找质量性状基因的分子标记的基本策略是比较轮回亲本、NIL及供体亲本三者的标记基因型，当NIL与供体亲本具有相同的标记基因型，但与轮回亲本的标记基因型不同时，则该标记就可能与目标基因连锁(图12-19)。目前，利用近等基因系分析法标记和定位了许多质量性状基因，如番茄抗病毒病基因Tm-2d (Young et al.，1988)和水稻半矮秆基因sdy (Liang et al.，1994)。

图12-19近等基因系分析法原理示意图(引自方宣钧等，2001)

在目标基因所在的染色体区域附近，检测到DNA标记的概率大小取决于被导入的染色体片段的长度及轮回亲本和供体亲本基因组之间DNA多态性的程度。检测概率随培育NIL中回交次数的增加而降低。当轮回亲本和供体亲本分别属于栽培种和野生种时，更有可能发现多态性的分子标记。相反，轮回亲本和供体亲本的亲缘关系越密切，其多态性的分子标记就越少。通过筛选大量分子标记可以提高获得与目标基因连锁的分子标记的机会。值得注意的是，在成对NIL间有差异的目标基因区段可能很宽，以致得到的标记座位可能与目标基因相距较远，甚至还有可能位于不同的连锁群上。另外，利用包含同一染色体区域的多个重叠NIL，可以减少在非目标区域检测到假阳性标记的机会，增加在目标区段中检测到多态性的概率。

二、分离集团混合分析法

分离集团混合分析法，也称分离体分组混合分析法(bulked segregation analysis,BSA)。BSA法最早是由 Michelmore等在1991年建立的。它克服了许多作物没有或难以创建相应的NIL的限制，在自交和异交作物中均有广泛的应用前景。对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物，利用BSA法也是进行快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。利用BSA法已标记和定位了许多重要的质量性状基因，如莴苣抗霜霉病基因、水稻抗稻瘿蚊基因及水稻抗稻瘟病基因。BSA法根据分组混合的方法不同可分为基于性状表现型和基于标记基因型两种。

(一)基于性状表现型的BSA法

根据目标性状的表现型对分离群体进行分组混合的BSA法，其基本思想是，在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异(如抗病与感病)，将个体或株系分成两组，然后分别将两组中的个体或株系的DNA混合，形成相对的DNA池。可以推测，这两个DNA池之间除了在目标基因座所在的染色体区域的DNA组成上存在差异之外，来自基因组其他部分的DNA组成是完全相同的，即为该作图群体基因库的一个随机样本。因此，这两个DNA池间表现出多态性的DNA标记，就有可能与目标基因连锁(图12-20)。在检测两DNA池之间的多态性时，通常应以双亲的DNA作对照，以利于对实验结果的正确分析和判断。为了可靠起见，在用BSA法获得连锁标记后，最好再回到群体上根据分离比例进行验证，同时也可估算出标记与目标基因间的图距。

图12-20基于性状表现型的BSA法分析示意图

(二)基于标记基因型的BSA法

基于标记基因型的BSA法是根据目标基因两侧的分子标记的基因型对分离群体进行分组混合。这种方法适合于目标基因已定位在分子连锁图上，但其两侧标记与目标基因之间相距还较远，需要进一步寻找更为紧密连锁的标记的情况。假设已知目标基因位于两标记座位A和B之间，即来自亲本1的标记等位基因为A₁和B₁，来自亲本2的为A₂和B₂。那么，在某个分离群体(如F₂)中，标记基因型为A₁B₁/A₁B₁的个体中，目标区段(即标记座位A和B之间的染色体区段)将基本来自亲本1，而A₂B₂/A₂B₂个体中的目标区段则基本来自亲本2，除非在该区段上发生了双交换，而理论上，双交换发生的概率是很小的。因此，可以将群体中具有A₁B₁/A₁B₁和A₂B₂/A₂B₂基因型的个体的DNA分别混合，构成一对近等基因DNA池，它们只在目标区段上存在差异，而在目标区段之外的整个遗传背景是相同的。这样就为在目标区段上检测多态性的分子标记提供了基础。用两个DNA池分别作为PCR扩增的模板，利用电泳分析比较扩增产物，寻找两DNA池之间的多态性，就可能在目标区段上找到与目标基因紧密连锁的DNA标记(图12-21)。

与前面所说的一样，获得连锁标记后，还可以进一步对它在群体中的分离情况进行验证，并确定它在目标区段中的位置。Goivannoni等(1991)以番茄为例讨论了目标区段的两连锁标记间的最佳区间长度和混合个体数。研究表明，随着混合体所含个体数的增加，在混合体中，个体在目标区间内发生双交换的概率也将增加。在F₂群体中，对于5cM的区间，当混合体所含个体数不超过40时，双交换概率小于10％。当目标区间增大到10cM时，混合个体数必须小于10，才能保持10％的双交换概率。但是随着样本数的减少，两类混合体间在除目标区段以外的区域出现差异的机会就会大大增加，从而导致PCR检测时假阳性的增加。因此，他们建议混合体所含个体数应大于5，目标区间的长度应小于15cM。

图12-21标记基因型混合分组，电泳显示的多态性标记应该存在于AB区段

(三)极端集团-隐性群法

近等基因系分析法和分离体分组混合分析法只能对目标基因进行分子标记分析，不能确定目标基因与分子标记间连锁的紧密程度及其在遗传连锁图上位置，而这些信息对于估价该连锁标记在标记辅助选择和图位克隆中的应用价值是十分必需的。因此，在获得与目标基因连锁的分子标记后，还必须进一步利用作图群体将目标基因定位于分子连锁图上。

近年来，Zhang等(1994)发展了分离集团分析法，提出的“极端集团-隐性群法”能够同时作目标基因与标记的连锁和定位分析。该方法的基本原理如下所述。①利用极端集团鉴别目标基因所在染色体区段。②用表现型为隐性的极端个体(隐性群)确定基因位点在分子标记连锁图上的准确位置。其基本做法是：首先，在分离群体中挑选表现型处于两个极端(如高度可育和高度不育)的个体组建两个极端集团，对极端集团及亲本进行分子标记分析，两集团间表现出多态性的分子标记(阳性标记)，极有可能与目标性状基因连锁，因此阳性标记所代表的即可能为目标基因所在区间；然后，以阳性标记对表现型为隐性的极端个体进行分析，得到各位点分子标记基因型，鉴别出分子标记与目标基因位点间重组纯合个体或杂合个体，用极大似然法计算标记位点与目标基因的重组值：

c＝(N₁＋N₂/2)/N

式中，N为所分析的表现型为隐性的极端个体总数；N₁为分子标记为重组纯合带型的个体数；N2为表现双亲杂合带型的个体数。其方差由下式给出：

Vc＝c(1一c)/2N

与一般的分离集团法相比，该法具有以下优点。①利用极端集团可提高基因定位的灵敏度和准确性，因为以表现型极端的个体构成极端集团，避免了随机群体中对性状硬性分组所造成的误差。特别是对一些受环境影响较大，难以简单划分表型的连续变异性状(如育性等)，通过极端表型个体分群，可提高研究结果的准确性。②利用隐性群估算基因位点间重组值，其效率远远高于F₂随机群体，这是因为采用隐性类型以极大似然法估算重组值的方差是采用F₂随机群体估算重组值方差的1/3～1/2。换言之，隐性群中每个个体所提供的关于遗传重组的信息较F₂个体要大得多，在同样精确度下，利用隐性群估算重组值所需的个体数仅为利用随机群体所需个体数量的1/3～1/2。因此以隐性群进行定位可大大降低分析成本。除光敏不育基因外，此方法已被应用于如白叶枯抗性、广亲和性、野败型雄性不育系育性恢复基因等多个基因的定位研究。