北京普天同创生物科技有限公司
1.微囊藻毒素的毒性和结构
水体中产毒藻类主要为蓝藻,如微囊藻、鱼腥藻和束丝藻等,其中,微囊藻可产生肝毒素,导致腹泻、呕吐、肝肾等器官的损坏,并有促瘤致癌作用;鱼腥藻和束丝藻可产生神经毒素,损害神经系统,引起惊厥、口舌麻木、呼吸困难,甚至呼吸衰竭。微囊藻毒素(microcystin,简称MC)是蓝藻产生的一类天然毒素,是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素,也是毒性较大、危害最严重的一种。目前已发现的微囊藻毒素有70多种,其中微囊藻毒素-LR是最常见、毒性最大的一种,结构如图6-2所示。
世界卫生组织(WHO)在《饮用水水质标准》(第二版)中规定,微囊藻毒素-LR在生活饮用水中的限值为1ug/L。我国现行的《生活饮用水卫生标准》
图6-2微囊藻毒素-LR的结构
(GB 5749-2006)和《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)中均规定微囊藻毒素-LR的限值为0.001 mg/L。
2.微囊藻毒素的检测方法
目前常用的微囊藻毒素的检测方法有生物(生物化学)测试法和物理化学检测法两类,其不同点在于检测原理、样品预处理的复杂程度,以及检测结果的表达形式。微囊藻毒素的几种检测方法的比较列于表6 -9。
表6-9微囊藻毒素的几种检测方法的比较
我国在《水中微囊藻毒素的测定》(GB/T 20466-2006)中规定采用高效液相色谱(HPLC)法和间接竞争酶联免疫吸附法测定饮用水、湖泊水、河水及地表水中的微囊藻毒素。《生活饮用水标准检验方法有机物指标》(GB/T5750.8-2006)中也规定采用高效液相色谱法测定生活饮用水及其水源水中的微囊藻毒素。以下介绍高效液相色谱法。
(1)原理。
水样中的微囊藻毒素经反相硅胶柱萃取(固相萃取)富集后,其各种异构体在液相色谱仪中分离,微囊藻毒素对波长为238 nm的紫外线有特征吸收峰,经紫外检测器检测,得到样品中不同的微囊藻毒素异构体的色谱峰和保留时间,与微囊藻毒素标准样品的保留时间比较可确定样品中微囊藻毒素的组成,依据峰面积可计算水样中微囊藻毒素的含量。
藻细胞中的微囊藻毒素经冻融、反相硅胶柱萃取浓缩后,可用高效液相色谱法测定。
(2)测定要点。
①水样的采集与制备:采集1~5L水样,0. 45 um滤膜减压过滤,滤液(水样)和藻细胞(膜样)分别进行不同的预处理。
a.水样处理(测水样中的微囊藻毒素):滤液→过5 g ODS柱→依次用50 mL去离子水、50 mL体积分数为20%的甲醇淋洗杂质→50 mL体积分数为80%的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥,残渣溶于10 mL体积分数为20%的甲醇→过C18固相萃取小柱→10 mL体积分数为100%的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥,残渣溶于1 mL色谱纯甲醇→20℃保存,待测。
b.膜样处理(测藻细胞中的微囊藻毒素):藻细胞(滤膜)。冻融三次→100 mL质量分数为5%的乙酸萃取30 min。以4000 r/min离心10 min,重复三次,合并上清液。上清液过500 mg ODS柱→15 mL体积分数为100%的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥,残渣溶于10 mL体积分数为20%的甲醇、过C18固相萃取小柱→10 mL体积分数为100%的甲醇洗脱→洗脱液在水浴中用氮气流挥发至干燥,残渣溶于1 mL色谱纯甲醇→-20℃保存,待测。
②测定:
a.色谱条件:高效液相色谱仪(配紫外或二极管阵列检测器),色谱柱(C18反相柱,长250 mm,内径4.6 mm,填料粒径5 um),柱温(40℃),流动相(甲醇与PH=3的磷酸盐缓冲溶液的体积比为57: 43,流量为1 mL/min)。
b.样品测定:准确取一定体积的待测样品和标准样品,同样条件下进样测定,记录其保留时间和峰面积,并按下式计算样品中微囊藻毒素的含量。标准样品谱图见图6-3。
图6-3微囊藻毒素MC-RR,MC-YR和MC-LR标准样品谱图
式中:P—水样中微囊藻毒素的质量浓度,ug/ L;
Ps—标准样品中微囊藻毒素的质量浓度,ug/L;
A—待测样品峰面积;
As—标准样品峰面积;
V1—待测样品的体积,mL;
V2—水样的体积,mL。
也可配制不同浓度的MC-RR,MC-YR和MC-LR标准溶液,在同样条件下测得各浓度标准样品和待测样品的峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线并在标准曲线上查出水样中微囊藻毒素的浓度。
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