实验一黄原胶分子形貌的原子力显微镜研究^[5]

黄原胶是一种自然多糖和重要的生物高聚物，以碳水化合物为主要原料，经发酵工程生产的一种作用广泛的微生物胞外多糖。该胶是目前国际上性能最优越的生物胶，具有独特的理化性质和功能，黄原胶可以溶于冷水和热水中，具有高黏度、高耐酸碱盐特性、高耐热稳定性、悬浮性和触变性等，常被用作增稠剂、乳化剂、悬浮剂和稳定剂，具有广阔的市场前景，广泛应用于食品、石油、医药、化工、纺织、化妆品等20多种行业。

黄原胶分子的化学式为(C₃₅H₄₉O₂₉)_n，其结构是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸组成的五糖重复单元，其结构如图26-2所示。一些学者认为黄原胶分子有时是有序的螺旋结构，有时则为无序的无规则线团，Moohrouse等利用X射线衍射发现黄原胶分子为螺旋结构。其水溶液呈多聚阴离子，构象具有多样性。Kirby等用接触模式下的原子力显微镜证明了黄原胶分子能够在正辛醇溶液中成像，然后他们进一步用轻敲模式研究黄原胶在任意环境下(溶液、空气和真空中等）的成像。Capron等用接触模式在丙醇二酸中研究了当加热温度超过分子从有序到无序的转变温度时，有序的结构会发生变形，同时相对分子质量降低。原子力显微镜分辨率高、制样简单、不需要导电，在任何环境(真空、大气和溶液）下都可以对样品进行成像。实验利用高分辨率的AFM，对不同浓度下的黄原胶分子的微观形态和结构进行考察，探讨浓度变化对黄原胶分子微观结构的影响规律。

图26-2     黄原胶的结构图

1.黄原胶溶液的样品制备

粉末状的黄原胶购买于Sigma-Aldrich公司，不需要进一步处理，黄原胶溶液的样品制备需要下列几个步骤。

1)用电子天平称取0.5g黄原胶粉末，将其溶解在50mL的三次蒸馏水中，在室温下搅拌，制备成10g/L的黄原胶母溶液，储存在4℃的冰箱中以备使用。

2)取l0g/L黄原胶母溶液，通过恒温磁力搅拌器加热到90℃，加热的过程中同时进行搅拌，大约需要30min，随后冷却到室温。

3)将溶液放置在离心速度为150000g的离心机，搅拌大约2h，目的是移除较大颗粒聚集物和一些气泡，取中间液放在4℃冰箱内保存24h。

4)取出1mL处理液，稀释到9mL的三次蒸馏水中，这个过程连续重复三次，最终制备出0.1g/L,0.01g/L和0.001g/L的黄原胶溶液。

2. AFM成像观测

将2 uL样品溶液滴在新离解的云母表面，成像之前在空气中千燥30～60min。AFM成像观测是在1000级的超净工作间的室温中进行的，所有的测量都是在空气中进行的。所测样品为生物样品，因此在实验中选用敲击模式下的原子力显微镜，扫描探针为美国Vecco公司生产，共振频率大约为145kHz，针尖尖端的直径接近20nm，弹性系数为5N/m。轻敲成像模式采用高频振动的探针扫描样品，探针与样品之间的每次接触时间极短，减少了针尖对样品的横向作用力，大大减少和避免了扫描过程中样品的飘逸和损坏。

实验二原子力显微镜在纳米材料表面形貌及粒度上的研究

纳米粒子(又称团簇、超微粒、超小粒子、量子点等)一般是指尺寸在1～100nm之间的粒子，是处在原子簇和宏观物体交界的过滤区域，从通常的微观和宏观观点看，这样的系统既非典型的微观系统也非典型的宏观系统，是一种典型的介观系统。它具有一系列新颖的物理化学特性，涉及体相材料中所忽略的或根本不具有的基本物理化学问题。

而纳米材料实际是由许多纳米粒子组成的，纳米材料成为物理、化学、材料以及生物等学科的重点研究领域。

羟基磷灰石(HAP)的化学式为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，其晶体结构属于六方晶系。羟基磷灰石的理论密度为3.16g/cm³，折射率为1.64～1.65，莫氏硬度为5,微溶于纯水，显弱碱性(pH为7～9)，易溶于酸，难溶于碱，离子交换能力强。

羟基磷灰石是脊椎动物骨和齿的主要无机成分(占人体骨组成的70％～90％)，结构也非常接近，与动物组织的相容性良好，无生物毒性，因此可以广泛用作生物硬组织的修复和替换材料，如口腔种植、牙槽脊增高等，是一种很有前途的生物活性陶瓷材料。羟基磷灰石由于具有独特的多孔骨架结构与生物体的相容性，还可以作为药物的载体，已经广泛应用于临床。本实验用化学沉淀法制备羟基磷灰石粉体，再压片放入马弗炉中锻烧，然后用原子力显微镜研究煅烧后的表面形貌、颗粒的大小随煅烧的温度和时间的变化规律。

1．试剂

Ca(NO₃)₂·4H₂O, AR; (NH₄)₂HPO₄, AR；氨水，AR。

2．实验仪器

AJ- Ⅲa型原子力显微镜；Rise-2008型激光粒度分析仪(济南润之科技有限公司)；81-2型恒温磁力搅拌器；FA2104S型电子天平;800电动离心机。

3．制备HAP粉体

在包含一种或多种离子的可溶性盐溶液中，加入沉淀剂(如OH^-、C₂O₄^2-、CO₃^2-等)后，于一定温度下使溶液发生水解，形成不溶性的氢氧化物、水合氧化物或是盐类从溶液中析出，将溶剂和溶液中原有的阴离子洗去，经热解或脱水即得到所需的纳米粉体。可溶性钙盐与磷酸盐溶液的复分解反应为

10Ca(NO₃)₂+6(NH₄)₂HPO₄ +8NH₃ +2H₂O→Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ +20NH₄NO₃

制备HAP粉体的步骤如下。

1)分别配制0. 50mol/L Ca(NO₃)₂溶液、0. 30mol/L (NH₄)₂ HPO₄溶液和25％氨水。

2)取100mL 0. 54mol/L Ca(NO₃)₂溶液置于烧杯中，在剧烈搅拌下，加入25％氨水调节pH为10. 6。

3)在搅拌的情况下，向0. 50mol/L Ca (NO₃)：溶液中逐渐滴加100mL 0. 30mol/L (NH₄)₂ HPO₄溶液，在滴加的过程中，要不断用25％氨水调节pH为10.6，使它维持pH一定。

4)滴加完毕后，再继续搅拌该反应溶液60 min左右，则得到白色的胶状HAP沉淀，将该沉淀沉化24 h后，过滤，再用去离子水和无水乙醇洗涤，过滤后于80℃干燥12h，干燥后的沉淀置于马弗炉中，在650℃下煅烧2h，得到的HAP粉体产品，研磨后装瓶保存。

4．制备羟基磷灰石片煅烧

将适量羟基磷灰石粉体装入模具(φ=6mm)，放入压片机内，在10MPa压力下压制成型。将所压制的样品柱置于陶瓷坩埚，放入马弗炉中，分别在450℃烧结2h和10h, 600℃烧结6h, 800℃烧结6h，得到不同烧结状态的样品。

5．原子力显微镜扫描

用原子力显微镜在室温大气条件下，对原粉和上述样品柱表面进行扫描测试。扫描时采用AFM接触模式，最大扫描范围为10um×10um，扫描频率设置为1. 07Hz。得到原始的表面形貌图像后，用后处理软件首先对其进行自动样品校正、自动清除扫描线的基本操作，然后做颗粒尺度分析。

实验三原子力显微镜扫描成像DNA分子

原子力显微镜对样品无特别要求，一经发明就在各研究领域特别是在生物大分子如DNA, RNA、蛋白质、病毒扫描成像研究领域得到了广泛的应用。本实验用原子力显微镜观察DNA的形貌^[6] 。

1．试剂

实验所用水均为去离子水；λ-DNA (48502个碱基对)购于NEB公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、戊二醛和组蛋白均购于Sigma-Aldrich公司。

2．样品制备

云母本身是层状结构，表面具有原子级别的平整度。用透明胶布可以方便地解理得到干净平整的表面。因此本实验将云母切割成合适大小，用双面胶u在直径约1 cm，厚约1mm的圆形铁片上，利用其作为衬底制备样品。

在实验时采用TE(10mmol/L Tris-HCI+1mmol EDTA, pH为8.0)缓冲液稀释λ-DNA。

图26-3是基本的样品处理流程图，在该流程基础上，可以增加或稍改变一些操作步骤，以适应样品制备需求。由于云母表面带负电，而DNA分子也带负电，单纯地将DNA样品沉积到云母表面，会由于静电斥力而不能稳定地沉积在云母表面。因而一般对云母表面进行修饰，或在DNA溶液中加入带正电的离子。沉积在云母表面的DNA构象一般是溶液中的线团状态在二维表面上的投影，仍然是二维蜷曲的。为方便观察或者统计分析，可以在必要时将DNA拉直成像。下面具体介绍这些样品的制备方法。

(1) Mg²⁺处理DNA方法

首先往TE溶液中加入MgC1₂溶液，使其最终浓度为3. 5mmol/L，然后用该TE+3.5mmol/L MgCl₂缓冲溶液稀释原始DNA液至1ng/uL。然后解理云母片得到新的一层云母面，用移液器取约10uL稀释DNA溶液滴在表面沉积3min，然后用约200uL纯水冲洗，氮气吹干后，放入干燥器1h以上待扫描。

图26-3     样品处理流程图

(2) APTES处理云母表面方法

首先取1％的APTES水溶液约30 uL，滴在新解理的云母表面，放置约15min，用超纯水冲洗约5min，氮气吹干，然后放置在120℃烘箱中加热30min(该步骤的目的是钝化表面)，冷却后放于干燥器中待用。之后，如图26-3所示，将1ng/uL的溶液10uL滴在云母表面，沉积3min，接着用纯水冲洗，并用氮气吹干，放入干燥器。

(3)戊二醛修饰云母表面方法

首先将50 uL 0. 01％戊二醛用移液器滴在APTES处理过的云母上，静置5min，然后用纯水冲洗5min，氮气吹干。接下来在该修饰云母上沉积DNA，步骤与图26-3基本相同。

(4) DNA拉直方法

首先将约10uL稀释DNA溶液或DNA一组蛋白复合物溶液滴在APTES处理过的云母片上(由于APTES的疏水作用，小液滴呈现小珠状)，样品沉积在云母表面约5min，用镊子夹着云母片与桌面成45^o,氮气从液滴上方与云母呈较小角度吹液滴，使其慢慢脱离云母表面。然后用移液器滴约20uL纯水在云母上，用移液器枪嘴稍微接触液滴的边缘，按照第(1)步中液滴移动的方向慢慢吸走样品，如此重复20次左右，用氮气吹干，干燥。

3．观察样品形貌

用原子力显微镜，以敲击模式观察样品形貌。