一、引言
      转基因大豆是全世界种植面积最大的转基因作物，由于导入了抗草甘膦基因EPSPS 基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)，可以编码磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶，能够耐受除草剂草甘膦的伤害，方便大豆农业生产和管理。但是，随着转基因作物在世界范围的广泛种植，其食用安全和环境安全问题也引起了广大消费者和各国政府的重视。转基因作物在实验室内产生，是大跨度、跳跃式的转移基因，不同于漫长的自然选择和相近物种的杂交，其本身的安全性未知，并可能对已有生物的多样性产生影响，全球公众对于转基因植物及其产品安全性的争论日趋激烈。因此，很多国家和地区纷纷制定转基因生物安全管理法规，实施标签制度，并积极开展转基因作物检测技术研究。
      转基因检测方法主要有核酸检测和蛋白质检测两种。其中核酸检测方法具有检测灵敏度高、适用范围广、操作简便等优点，且核酸在生物细胞中含量相对稳定，在产品加工中也不易破坏，因此核酸检测成为转基因产品的主要检测方法。目前国内外转基因产品核酸定量检测相关标准物质很少，国内可检索的有证标准物质只有一种转基因大豆粉末标准物质。针对这种现状，我们研制了一种适用于转基因大豆GTS40-3-2定量检测的质粒DNA标准物质，以质粒DNA浓度作为唯一特性量值，遵照ISO导则35的要求，我们对标准物质开展了严格的考查和数据统计。该质粒DNA分子序列经过多家单位验证，我们对其中外源基因和内标准基因的比值进行了分析。该标准物质可以用于转基因大豆GTS40-3-2定量检测进行质量控制和方法验证，确保检测结果在国内外测量的可靠性、可比性和溯源性。该标准物质研制的完成，对于增强不同实验室测量结果互认、提升我国转基因检测水平具有重要的现实意义。
      二、实验部分
      1.仪器与试剂
      转基因大豆粉GTS40-3-2标准物质GBW (E)100043，重铬酸钾溶液标准物质GBW(E)081609(购自中国计量科学研究院)；限制性内切酶、高保真Taq酶、dNTP、T4连接酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞、质粒pUC19等(宝生物工程有限公司)；引物合成(上海生工生物工程有限公司)；其他生化试剂均为分析纯。快速梯度PCR仪(ABI)； 实时荧光定量PCR仪(Life technologies)； 微量核酸蛋白定量仪(nanodrop2000)；高分辨电感耦合等离子体质谱(Thermo Element 2)。
      2.序列设计
      根据转基因大豆GTS40-3-2外源插入载体在转基因作物中的具体插入方式和拷贝数，以及外源插入载体中主要元件的序列信息，设计3对PCR引物(见表1)，分别用于扩增转基因大豆GTS40-3-2的结构特异性基因、品系特异性基因、大豆内标准基因Lectin特异性序列。

      3.质粒DNA分子的构建
      根据表1的引物，以转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA为模板，对其结构特异性序列、品系特异性序列及大豆内标准基因序列进行PCR扩增，对产物进行回收纯化。将3段基因序列分别克隆至载体pUC19上，大量培养重组大肠杆菌，经提取和纯化获得质粒DNA分子pXL02水溶液样品。琼脂糖凝胶电泳及微量核酸蛋白定量仪检测其纯度。质粒DNA标准物质溶液置于-20℃保存。
      质粒DNA标准物质pXL02的构建流程图如图1所示。

      4.高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)方法检测质粒DNA浓度的方法
      质粒标准物质样品中磷元素的含量和质粒分子的浓度有固定线性关系，在DNA中，每个碱基对应一个磷原子，分子中磷元素含量(质量分数)可由下式计算:含磷量(P%)=碱基数×磷的原子量÷DNA分子量。由此计算得出pXL02的含磷量(P%)为10.19%。HR-ICP-MS测量条件: 冷却气流量16.86L/min，辅助气流量0.99L/min，雾化气流量1.123L/min，功率1350W。
      5.均匀性检验
      按照JJF1006-1994《一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，采用了UV法对质粒DNA标准物质的均匀性进行了考查。从标准物质样品中随机抽取15瓶，每个样品重复测定3次。
      6.稳定性考查
      分别在制备完成后1、2、3、6、8、10、12个月，对质粒DNA标准物质随机检测，检测方法采用UV法，每次抽取3瓶，每个样品重复测定3次。
      7.标准物质定值
      以质粒分子的浓度作为特性量值，采用UV法和HR-ICP-MS法对质粒进行定值，两种检测方法均经过严格的考查和验证，具体结果见三、2部分。由10家实验室对质粒DNA标准物质进行联合定值，每个实验室分别随机分发1瓶质粒DNA标准物质，平行测定8次。
      三、结果与讨论
      1.质粒DNA标准物质的构建
     (1)将PCR扩增得到的709bp的结构特异性序列、337bp 的品系特异性序列和570bp的大豆内标准Lectin基因序列依次克隆到pUC19载体上，获得质粒DNA标准物质pXL02，总序列为4266bp。提取之后经琼脂糖凝胶电泳(见图2)及微量核酸蛋白定量仪检测，纯度符合要求。
     质粒DNA标准物质电泳分析结果:泳道1为NheⅠ酶切产物，泳道2为SalI酶切产物，条带3为EcoRⅠ酶切产物电泳结果，泳道4为marker。(2)为了验证质粒分子序列正确性，并检验外源序列与内标准基因的比例，我们对质粒分子进行了多家单位多次重复序列验证，实验结果证明，质粒DNA标准物质插入序列与预期设计完全符合，其转基因大豆GTS40-3-2的外源结构特异性序列、品系特异性序列、大豆内标准基因Lectin序列，均为单拷贝连入，即外源序列与内标准基因比例为1∶1。表2为具体验证实验结果。

     (3)大豆品系特异性基因和内标准基因比例的参考值确定
      采用PCR方法测得Ct值之比作为依据，分析了该质粒DNA分子的品系特异性基因片段GST与内标准基因片段Lectin的比例，结果Ct(GST)/Ct(Lectin)=1.0，标准偏差为0.032。结果数据如表3所示。

      2.定值方法考查结果
     (1)紫外分光光度法(UV)检测质粒DNA的方法考查结果
      以重铬酸钾溶液标准物质考查UV法重复性和基线平直度，结果符合标准要求；以小牛胸腺DNA成分标准物质考查紫外分光光度计检测DNA的准确性，结果符合标准物质标称值和不确定度范围。
     (2)HR-ICP-MS方法检测质粒DNA的方法考查结果
      利用磷标准溶液建立标准曲线，检测线性达到0.9997；对定量限进行考查，得出HR-ICP-MS的检出限为0.06μg/L、测定下限为0.21μg/L，这些实验数据表明该方法检测质粒DNA标准物质的精密度良好。
      3.均匀性检验结果
      采用UV法，以质粒浓度为主要量值，以1μL为最小取样量，采用方差分析法对该质粒DNA标准物质进行均匀性检验，在95%置信水平下，该套标准物质符合JJF1006-1994《一级标准物质技术规范》均匀性检验合格要求。具体统计数据如表4所示。

     4.稳定性考查结果
     采用UV法，以质粒浓度为主要量值，对质粒DNA标准物质的稳定性进行考查，考查结果见图3。采用线性模型对稳定性考查数据进行统计。结果显示，稳定性斜率β1的绝对值<t_0.95，10×s(β1)，斜率不显著，表明该质粒DNA标准物质在规定时间内无明显变化趋势，可以判定质粒DNA标准物质在-20℃条件下可以稳定保存12个月。

      5.质粒DNA标准物质定值和不确定度评估
     (1)定值结果
     质粒DNA标准物质采用10家实验室协同定值，经过数据检验和统计得到定值结果为137.0ng/μL(3.18×10¹⁰copies/μL)，结果如表5所示。
     (2)不确定度评定

      经统计，质粒DNA标准物质的不确定度来源由3部分组成。第一部分为标准物质的不均匀性引起的不确定度u_bb=0.29ng/μL；第二部分为标准物质在有效期内的变动性引起的不确定度u_s=1.26ng/μL； 第三部分为标准物质的定值过程带来的不确定度u_char=5.3ng/μL，其中包括数据统计引入的不确定度和通过对定值过程中影响因素进行分析评定得到的不确定度。将合成标准不确定度乘以包含因子k=2(置信区间P=0.95)，得到扩展不确定度。质粒DNA标准物质定值结果及不确定度如表6所示。

      6.质粒DNA标准物质与基体标准物质等效适用性验证
      采用质粒DNA标准物质建立定量PCR标准曲线，对转基因大豆GTS40-3-2标准物质(ERM-BF410gk，转基因含量为10%)进行分析，定量分析结果显示该样品的转基因含量为11.54%，与真实值的偏差为15.4%，检测结果的偏差在ISO转基因食品检测标准允许的0～0.25范围内。
      四、结束语
      本研究研制的转基因大豆GTS40-3-2定量检测质粒DNA标准物质，采用UV法和HR-ICP-MS法多家实验室联合定值，结果量值可靠，准确性、均匀性和稳定性良好，满足《一级标准物质技术规范》要求。该标准物质的研制为转基因大豆的定量检测提供了量值溯源的依据，为转基因大豆检测实验室质量控制提供有力保障。相信通过相应标准物质在我国转基因作物检验实验室的推广应用，能够进一步提高转基因作物检验实验室相关项目的检测水平，保障各实验室测量结果的可比性、准确性，为检验结果的互认和共享打下了良好的基础。
转载自中国计量网