加巴喷丁（gabapentin）是γ–氨基丁酸（GABA）的衍生物，是辅助治疗癫痫、增强神经抑制和控制神经兴奋的新一代药物［1］,在临床上应用广泛。加巴喷丁的检测方法有光度法［2］、毛细管电泳法［3–4］、电位法［5］、高效液相色谱法［6–9］、质谱法［10］、液质联用法［11］等。由于灵敏度和仪器设备的制约，人们更加倾向于使用高效液相色谱法，但文献报道的紫外检测比较繁琐、费时。

利用柱前衍生化技术，样品组分经特定化学反应转变为发光或发色衍生物，再进行色谱分离测定，该技术的优点是：不必考虑衍生化反应动力学，直到衍生反应完全；可任意选定衍生化条件，柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时流动相相匹配；衍生化副产物可进行预处理以降低或消除其干扰。相比之下，柱前衍生法对仪器要求相对较低，优点突出，适用性广，应用更为广泛［12］。

柱前衍生技术的关键在于衍生试剂的选择，常用衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）［13–14］、2，4-二硝基氟苯（DNFB）［15］、对酞内酰胺基苯甲酰氯（PIB–Cl）［16］、对甲基苯磺酰氯（MBS–Cl）［17］、丹磺酰氯（Dns-Cl）［12，18］、荧光胺（FA）［19］等。对甲氧基苯磺酰氯（MOBS–Cl）作为柱前衍生试剂尚未见文献报道。笔者以加巴喷丁胶囊为参比药物，结合实验室条件，参考Tomita等［20］的方法选用高效液相色谱对加巴喷丁进行检测，并对其衍生化条件进行优化，建立了可靠的测定方法。

1实验部分

1．1主要仪器与试剂

液相色谱系统：LC–10A型，包括两个LC–10AVP色谱高压泵、一个CTO–10ASVP柱温箱、一个DGU–12A在线脱气机、一个7725i手动进样器、一个SPD–10AVP紫外检测器、一个有SCL–10AVP控制器的CLASS–VPLC工作站，日本岛津公司；分析柱：反相ODS柱（150mm×4.6mm，5μm），日本岛津公司；低速离心机：TDL80–2B型，上海嘉鹏科技有限公司酸度计：pH–3C型，上海分析仪器厂；数控超声仪：KQ–500GVDV型，昆山超声仪器有限公司；数控恒温水浴锅：501A型，上海实验仪器厂；盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、甲醇、乙腈：色谱纯；加巴喷丁对照品：纯度不小于99.0%，武汉远城科技发展有限公司；加巴喷丁胶囊：标示量为0.1g，江苏省恩华药业股份有限公司；对甲氧基苯磺酰氯：上海晶纯试剂有限公司；

其它所用试剂均为分析纯；实验用水为超纯水，用Milli-Q系统过滤制得。

1．2实验方法

1.2.1加巴喷丁的衍生化

取加巴喷丁粉0.01g溶于4mL水中，过滤备用。取0.1g对甲氧基苯磺酰氯溶于4mL乙腈中，过滤备用。pH10.0的Na2HPO4缓冲液过滤后备用。按表1的量配制0#～2#溶液，在50℃条件下加热30min后定容至1.0mL。

1.2.2色谱条件

流动相：Na2HPO4缓冲液（0.05mol／L，pH10.0）–甲醇混合液（体积比为60∶40），流量为0.8mL／min；柱温：室温；检测波长：240nm；进样体积：20μL；每个样品重复进样3次。

1.2.3衍生条件的选择

分别改变反应温度、反应时间、衍生剂浓度、Na2HPO4缓冲液的酸度考察检测结果，以获得最佳的衍生条件。

1.2.4最低检测限的计算

按照式(1)计算方法的最低检测限：

1.2.5方法精密度试验

同一样品溶液重复进样5次，计算变异系数以考察方法的精密度。

1.2.6样品测定

取加巴喷丁胶囊20粒，精密称定，计算得平均粒重，精密称取约相当于加巴喷丁100mg的细粉，置于100mL容量瓶中，加适量水，超声30min，使之充分溶解，加水稀释至标线，混匀，用微孔滤膜滤过，取滤液5mL，置于25mL量瓶中，加入15mL对甲氧基苯磺酰氯，以pH10.0的Na2HPO4缓冲液稀释并定容，摇匀，于50℃水浴中放置15min，取20μL进样测定。利用标准工作曲线计算样品溶液的浓度，进而求得加巴喷丁的质量分数。

2结果与讨论

2．1检测波长

加巴喷丁和对甲氧基苯磺酰氯衍生反应后，取反应液进样检测，经反复多次比较，在检测波长240nm条件下检测加巴喷丁灵敏度最高，对甲氧基苯磺酰氯水解产物灵敏度相对较低，干扰较小，因此选择检测波长为240nm。

2．2衍生反应

盐酸加巴喷丁结构中没有强的发色基团，仅在198nm波长处具有较强的末端吸收，在此波长下无法直接用分光光度法检测，需进行衍生化，使加巴喷丁结构中增加强的发色基团。

对甲氧基苯磺酰氯是一种常用的磺酰化试剂，可将伯胺与仲胺磺酰化，盐酸加巴喷丁有一个伯胺基，它能与对甲氧基苯磺酰氯反应，该反应产物在240nm波长下有最大吸收，而衍生化试剂在此条件下不干扰测定。

加巴喷丁与对甲氧基苯磺酰氯在碱性条件下发生反应的方程式见图１。加巴喷丁与对甲氧基苯磺酰氯反应生成物用反相色谱柱等度洗脱进行分离，标准溶液的色谱图见图2。由图2可见，加巴喷丁、衍生剂水解产物可以良好分离。

2．3衍生反应条件

按1.2.1的基础方法，改变衍生化反应的时间，分别设置为30，60，90，120，150min，测定并比较色谱峰面积。结果表明，在实验选取的范围内，反应时间对衍生效率没有明显影响。

改变衍生化反应的温度，分别设置为30，40，50，60，70℃，测定并比较色谱峰面积。结果表明，反应温度与衍生化效率密切关联，在30～50℃范围内衍生化效率随温度的升高而升高，50℃时衍生化效率达到最大值，随后衍生化效率随温度的进一步升高而呈下降趋势。

改变Na2HPO4缓冲液的pH值，分别设置为9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，测定并比较色谱峰面积。结果表明，Na2HPO4缓冲液的pH值对衍生化效率有一定影响，在pH9.5～10.5的范围内随pH值的升高而升高。Na2HPO4缓冲液的pH值超过11.0后，衍生化效率随pH值的升高而下降。

改变衍生剂的用量，每10mL加巴喷丁溶液中分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL对甲氧基苯磺酰氯溶液，测定并比较色谱峰面积。结果表明，对甲氧基苯磺酰氯溶液的用量为1.5mL时已经饱和，继续增大其用量对衍生效率无影响。

2．4线性范围与检出限

在本实验条件下，加巴喷丁溶液的质量浓度在1～100mg／L范围内与色谱峰峰面积线性良好。回归方程为A=24.5667c+12.3025，线性相关系数r=0.9999。将相关数据代入式(1)计算得方法最低检出限为0.017μg／g。

2．5方法精密度

取加巴喷丁样品溶液，连续测定5次，色谱峰面积测定结果见表2。由表2可知，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.56%，表明本方法测量精密度良好。

2．6样品测定结果

按照1.2.6进行样品测定，测定结果列于表3。由表3可知，本方法测定值与标示量基本吻合，表明测量准确度较高。

3结语

作为一种新型紫外衍生试剂，对甲氧基苯磺酰氯可使加巴喷丁在C18柱中得到良好的分离，并在紫外光区有较大的摩尔吸收系数，从而可提供一种灵敏的衍生物定量方法。加巴喷丁与对甲氧基苯磺酰氯的衍生反应效率受多个条件的影响，本实验所涉及的因素中，反应缓冲液的pH值、盐浓度及反应温度均对衍生效率密切相关，其最佳条件：反应缓冲液pH值为10.5~11.0、盐浓度0.4mol／L，对甲氧基苯磺酰氯与加巴喷丁质量比大于7.5∶1，于50℃水浴反应30min。在所选择的HPLC测定条件下，加巴喷丁溶液的质量浓度在1～100mg／L范围内线性关系良好，精密度高，色谱峰峰型尖锐对称，分离度良好，最低检测限为0.017μg／g。