甘氨酸（glycine，又名氨基乙酸或乙氨酸）是氨基酸系列中结构最简单、组成蛋白质的20多种氨基酸中的一种，为人体非必需的一种氨基酸。因为它具有特殊甜味，能缓和酸、碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味，故又被称为胶糖。目前甘氨酸被广泛地应用于医药、食品、农药等领域［1–3］。人体若摄入过量的甘氨酸，不仅不能吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。以甘氨酸为主要原料生产的含乳饮料，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。目前，氨基酸的检测多采用衍生化气相色谱及

高效液相色谱法，但方法均较繁琐，费用高［4–5］，鲜牛奶中氨基酸的测定多采用分光光度法，此类方法只能检测氨基酸的总量［6–7］。我国国家标准中规定［8–9］：食品中氨基酸的测定采用氨基酸与茚三酮衍生法的氨基酸分析仪检测；乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定采用酸碱滴定法。但经大量实验说明前法存在分析误差大（10%～20%）、分析柱再生复杂及耗时长等问题，后法仅能测定氨基酸的总含量。笔者利用高效毛细管电泳法，茚三酮作为衍生试剂测定了纯奶中甘氨酸的含量，用氯化镁作为奶样蛋白沉淀剂，沉淀效果较好。笔者重点研究了茚三酮与甘氨酸衍生条件，在加热时，样品中加入沸石并使用了专用的自动控温加热装置，这一步骤成为样品显色均匀且稳定的重要条件。

1实验部分

1．1主要仪器与试剂

高效毛细管电泳仪：TH–3000型，保定天惠分离科学研究所；未涂层毛细管：60cm×75μm，河北永年光导纤维厂；自动双重纯水蒸馏器：SZ–93型，上海亚荣生化仪器厂；酸度计：pH–3C型，上海伟业仪器厂；超声波清洗器：SK5200H型，昆山市超声仪器有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、硼砂、氢氧化钠、无水乙醇、丙酮、乙腈、乙二醇、和茚三酮：分析纯；

标准品甘氨酸：生化试剂，上海蓝秀科技发展有限公司；实验用水均为二次蒸馏水。

1．2溶液配制

甘氨酸标准溶液：准确称取0.1000g甘氨酸标准品，加水溶解于100mL容量瓶中，用水溶解并定容，配成1.0000g／L甘氨酸储备液。分别准确移取0.00，0.10，0.50，2.50，5.00，7.50，10.00mL甘氨酸储备液于50mL容量瓶中，加入1%氯化镁溶液15mL，水定容至刻度，摇匀。配制成0.00，2.00，10.00，50.00，100.00，150.00，200.00μg／mL甘氨酸标准溶液。

衍生缓冲溶液：配制4.9mmol／L硼砂–0.25mmol／L氢氧化钠（pH9.0）硼酸盐缓冲溶液。

分离缓冲溶液：配制8.2mmol／L磷酸氢二钠–3.5mmol／L磷酸二氢钾（pH6.8）磷酸盐缓冲溶液。

1.3样品预处理

称取5.00g纯奶置于25.0mL具塞刻度试管中，加入1%氯化镁溶液15mL，用水定容至标线，超声5min，将混合液倒入烧杯中，电炉加热至微沸，静置冷却至室温，待蛋白颗粒沉淀长大，离心分离5min，上层清液经0.3μm针头式过滤器过滤备用。

1．4电泳分离检测条件

未涂层弹性石英毛细管柱（60cm×75μm，有效长度49cm）；压力进样:25kPa，3s；电泳电压：25kV；电泳温度：室温；检测波长：570nm；运行缓冲溶液：8.2mmol／L–磷酸氢二钠–3.5mmol／L磷酸二氢钾（pH6.8）。

毛细管在使用前用1mol／L氢氧化钠冲洗20min，然后用二次蒸馏水和分离缓冲液各冲洗5min。每次分析样品后，用缓冲溶液冲洗毛细管柱2min，以保证重现性。

2结果与讨论

2．1样品前处理方法的优化

2.1.1沉淀剂的选择

称取5.00g纯奶于25.0mL具塞试管中，分别用磺基水杨酸、三氯乙酸、内酯和氯化镁作为蛋白沉淀剂。对于纯奶样，用磺基水杨酸作为沉淀剂时检测奶样时出现杂峰，影响检测结果。用三氯乙酸沉淀奶样时蛋白沉淀不完全，而内酯为沉淀剂时，加入茚三酮衍生试剂，样品不显色。采用氯化镁作为蛋白沉淀剂，不仅可以使蛋白质沉淀完全，而且处理后的样品与茚三酮溶液显色明显，检测时无杂峰且测量值稳定，因此实验选择氯化镁作为蛋白沉淀剂。

2.1.2样品处理操作

纯奶样加入氯化镁沉淀剂后，在加热时，为防止爆沸，避免沉淀蛋白浑浊，加热至微沸后，奶样静置、冷却至室温，使蛋白聚集变大，利于蛋白沉淀完全。

2．2衍生条件

2.2.1衍生缓冲溶液pH值

由于茚三酮溶液与甘氨酸的反应是在酸性的条件下进行的，选择pH6.80的磷酸盐［7］作为衍生反应的缓冲溶液，与文献［10–11］提供的缓冲溶液比较，该条件下样品反应完全，显色稳定。

2.2.2茚三酮溶剂

分别选择乙二醇、纯水、乙腈、丙酮和无水乙醇作为茚三酮的溶解溶剂进行试验。样品沸腾是显色的重要条件，选用乙二醇或水作为茚三酮溶液溶剂时，样品在沸水浴中不沸腾、不显色。乙腈作为溶剂时，茚三酮易溶解，但乙腈毒性较大。丙酮作为溶剂，其沸点较低，沸水浴时爆沸，测定结果不稳定。采用无水乙醇作为溶剂，样品加热不爆沸且显色明显，测定结果重现性较理想，因此选择无水乙醇作为茚三酮的溶解溶剂。

2.2.3加热条件

选用无水乙醇作为茚三酮的溶解溶剂，在12min水浴时，样品中加入沸石，防止溶液爆沸，将试管固定于支架上，水浴自动控温装置将温度控制在96℃，电动搅拌器的转速为250r／min，此条件下，样品加热更均匀、稳定，改善了样品测定的重现性。

2.2.4氯化镁溶液及沸石对衍生反应的影响

经实验证明，样品中加入氯化镁溶液对衍生反应有增敏效应，甘氨酸茚三酮衍生强度提高一倍；样品中加入沸石对衍生反应有加速和增敏双重效应，反应时间由15min缩短为12min，衍生强度增加一倍，结果见图1。

2．3电泳条件

2.3.1检测波长

在紫外区，波长为230nm处检测时，茚三酮有很大吸收，甘氨酸与茚三酮衍生后，峰值变化不明显；在可见区，波长为570nm处检测时，茚三酮吸收值小，背景影响小，检测甘氨酸衍生物时，有较大吸收值，并且随甘氨酸浓度的增加响应值呈线性增加，因此选用可见区波长570nm作为检测波长。

2.3.2分离缓冲溶液pH值

在缓冲溶液为酸性条件进行检测时，甘氨酸–茚三酮衍生物无吸收峰；选择碱性的缓冲溶液（pH9.0）时，可检测出甘氨酸–茚三酮衍生物的吸收峰，且随甘氨酸含量的增加衍生物的响应值呈线性增加，因此选择pH9.0的硼酸盐溶液作为分离缓冲溶液。

2．4线性与检出限

配制成0.00，2.00，10.00，50.00，100.00，150.00，200.00μg／mL的甘氨酸标准溶液，按照1.4的条件测定峰面积Y，方法的相关系数≥0.999，结果见表1。本方法选择标准系列中检出限进样浓度2μg／mL计算该方法的检出限，结果见表1。

2．5方法的重现性和精密度

随机抽取不同生产厂家纯奶样进行检测，取样量5.00g，按照1.3和1.4的条件进行处理，测定结果如表2。纯奶样中甘氨酸含量的高效毛细管电泳谱图如图2。

2．6回收试验

对表2中的纯奶样1进行加标回收试验，结果见表3。由表3可知，回收率为88.7%～107.2%，说明方法的准确度较高。

3结语

利用高效毛细管电泳仪选择性测定了纯奶样中的甘氨酸的含量，克服了分光光度法只能测定氨基酸的总量的缺点，解决了茚三酮显色重现性差的问题。该法灵敏度较高，结果较满意，可用于乳品生产的产品检验。