蜂蜜中含有兽药残留的主要原因是在蜂病防治过程中所使用的抗生素类兽药未遵守休药期规定、非法使用违禁药物、不合理用药等。农药残留是指蜜蜂在外出采蜜时，花蜜来源的农作物喷洒了农药，蜜蜂将其携带回蜂箱导致蜂产品中农药残留。
     蜂蜜中主要的残留抗生素种类主要有氯霉素类、β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、氨基糖苷类和硝基呋喃类等。农药残留主要涉及除虫剂、除草剂和杀菌剂等。中国、日本、欧盟等国家和地区相继制定了严格的技术性法规、标准，并不断降低检测限，增加药物项目种类。我国也为此制定了一系列蜂蜜中农兽药残留的检测方法标准，国内外关于蜂蜜中农兽药残留的检测标准和技术文献也有大量文献报道。农兽药残留检测技术主要包括两个方面:一是样品前处理技术；二是检测技术。本文从样品预处理和检测两个方面对蜂产品重点农兽药残留检测技术进行介绍。
      一、蜂蜜中农兽药残留的样品预处理方法
     蜂蜜是一种成分极为复杂的糖类复合体，到目前为止，已经鉴定出蜂蜜中含有180多种不同的物质。其中成熟蜂蜜总含糖量达75%以上，水分占18%～22%，其他成分还包括酸类、矿物质、维生素、酶类、蛋白质、氨基酸、胶体物质等。这些物质的分子结构、分子大小、理化性质各异，其中许多化合物的性质目前尚不明确，其中任何一种物质的含量可能是兽药残留组分的数百倍甚至数万倍以上。这些样品基质的存在，不仅干扰对待测物的检测，还会污染仪器和降低设备的使用寿命。样品处理的最终目的是将待测组分从样品基质中分离出来，并达到分析仪器能够检测的状态，其主要作用包括将药物从样品中释放出来，除去样品中的干扰杂质，将待测组分转换为可检测的形式、达到可检测的浓度范围和溶于可分析的介质。
样品处理通常包括提取、净化、浓缩和衍生化4个步骤。在设计样品处理方法时应考虑样品的理化性质、存在状态、样品基质的化学组成、干扰物的可能存在类型、处理方法对药物稳定性的影响和采用的测定方法。
     1.提取方法
     提取就使用物理的和化学的手段破坏待测组分和样品基质之间的结合力，将待测组分从样品中释放出来并转移到易于分 析的溶液状态。样品提取常用的方法有组织捣碎法(匀浆)、振荡法、涡旋法、超声波辅助提取、超临界流体萃取、索氏提取法、加速溶剂萃取、微波辅助提取等。在蜂蜜农兽药残留中最常用的是振荡提取和涡旋混匀。由于蜂蜜中主要是易溶于水的糖类物质，国标和文献中的方法多为用水稀释后，涡旋混匀，经过离心处理后，取上清等待进一步净化处理。
      2.净化方法
     在样品提取过程中，许多与待测组分溶解性相似的杂质将被一起转移出来，净化就是将待测组分与杂质进行分离。提取过程一般可以去除99%以上的样品基质，这些不到1%的共萃取物是主要的样品测试的干扰杂质，尤其是对于质谱检测，会引起严重的基质效应，同时也可能会增加基线噪声，降低柱效，阻塞色谱管路等。有时这些杂质可能不会直接干扰检测，但大量的杂质会干扰色谱分离过程，导致待测物峰形异常和保留值变异增加。因此，为保证测定的正常进行，必须在净化过程中去除这些杂质。常用的净化方法有液-液萃取、固相萃取、固相微量萃取、凝胶渗透色谱法、基质固相分散技术、免疫亲和色谱、分子印迹技术、膜萃取等。蜂蜜中抗生素残留检测用到的主要是固相萃取法，OASIS HLB的反相保留机理的固相萃取柱，在蜂蜜中抗生素残留检测中用途最广。
     3.浓缩、富集和衍生化方法
     在残留分析中，经过提取和净化后的待测组分的存在状态经常不能满足仪器分析的要求，如浓度低于检测器的响应范围、待测物的溶剂与色谱不兼容等。因此需要进行浓缩、富集，或进行溶剂转换。减压蒸馏和气流吹蒸是常见的浓缩方法。当待测物在选定的检测器上无响应或灵敏度太低，或其理化性质不适于进行色谱分离时，可进行化学衍生化以改变组分的性质，使其能够在检测器上产生响应或改善色谱行为。50°C下氮气吹干，是蜂蜜样品最常用的浓缩方法。蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定方法，需要对样品进行衍生化处理，因为4种硝基呋喃类抗生素是以简单的代谢物的形式存在于样品中，而4种化合物代谢物的分子量较小(<200)，质谱响应较弱，检测灵敏度低，所以需要衍生化提高质谱检测灵敏度。
     二、蜂蜜中农兽药残留的仪器检测方法
     按分离或检测原理不同，残留分析可分为理化分析方法，如色谱法及其联用技术、波谱法等；免疫分析法，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法等；生物测定法，如微生物学测定法、放射受体测定法等。蜂蜜中农兽药残检测标准中主要应用的检测技术包括:液相色谱法、气相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相质谱色谱联用法、杯碟法、酶联免疫法等。
     1.色谱法
     色谱法分为气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、毛细管电泳(CE)。其中，气相色谱法适合分离沸点比较低、热稳定性好的化合物。高效液相色谱法特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析。薄层色谱法具有设备简单、操作方便、分析速度快的优点，但是定量的准确性差，只是一种定性方法。与HPLC相比，毛细管电泳法具有操作简单、色谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效率高、样品用量少、运行成本低等优点，但毛细管电泳迁移重现性、进样准确性和检测灵敏度方面不及HPLC，在残留分析的应用中受到一定限制。目前残留分析中，HPLC和GC，由于其强大的分离能力、强健的稳定性，并且能够实现与各种检测方法连在一起，已成为主流的分析方法。
     (1)液相色谱法和气相色谱法
     色谱法是利用物质在液相和固相或者气相和固相中吸附或分配系数的微小差异而达到分离目的。其最大的特点在于能将复杂的混合物分离为各个有关的组分后，逐个加以检测。色谱法具有高效、快速、灵敏的特点，液相色谱与气相色谱相比，其最大特点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，而这类物质在已知化合物中占相当大的比例。
     蜂蜜中农兽药残留检测中液相色谱法和气相色谱法都有应用。蜂蜜中链霉素、四环素类、磺胺类、甲硝达唑类等采用液相色谱串联紫外检测器或二极管阵列检测器进行检测，方法的检出限在0.01mg/kg，但是随着一些兽药残留限量标准的提高，0.01mg/kg的检出限水平已经不能满足检测的需要。气相色谱法一般用于检测蜂蜜中的农药残留，如有机磷农药、杀虫脒、双甲脒等、菊酯类农药等，方法的检出限也在0.01mg/kg左右。
     (2)液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法
     色质联用一般是指液相色谱或气相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱或气相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化 后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。色质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
随着液相色谱串联质谱技术的快速发展，蜂蜜中抗生素残留的检测标准中采用液相色谱串联质谱方法的占多数，主要包括氯霉素、四环素类、青霉素类、大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类、头孢类、硝基呋喃类等抗生素的检测。较液相色谱法，液质联用方法的检出灵敏度大大提高，方法的检出限在(0.1～10)μg/kg范围内，比液相色谱法的灵敏度提高3～5个数量级。气相色谱质谱联用技术应用于农药残留检测的比较多，蜂蜜中双甲脒、杀虫脒、溴螨酯等农药残留的检测标准均使用了气质联用技术，方法灵敏度在(10～40)μg/kg范围内。
      2.酶联免疫分析法
     免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键、范德华力和疏水区域的综合作用，因而具有单独任何一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，非常适用于复杂基质中痕量组分的分离或检测。但是，免疫测定法提供的待测物组成或结构方面的信息太少(仅为吸收度或计数)，一般不具备多残留分析能力；免疫分析过程复杂，影响因素众多且不易控制，结果易出现假阳性，方法难以标准化；方法建立过程复杂，研究周期长，某些待测物的半抗原难以合成。免疫测定法不可能取代色谱或光谱等常规分析方法，只能作为其重要补充。蜂蜜中四环素、泰乐菌素、氯霉素等抗生素还有使用酶联免疫法的国家标准，但是使用率不高。
     3.微生物测定法
     微生物法是用于测定抗生素效价的生物学定量方法之一。标准的方法是以20mL的琼胶培养基放入陪替氏培养皿内做成平面，上面加上预先培养的试验标准菌种，例如掺入了葡萄球菌的琼胶4mL，而使之凝固，上面再放上一个外径8mm的不锈钢圆筒，筒内倒满青霉素稀释液后，在35℃～37℃培养(12～16)h。由于圆筒周围产生浓度梯度，葡萄球菌的繁殖被阻止于有效浓度范围之内而形成圆形的透明带。其直径d与青霉素浓度c之间的关系如下式所示:d=klog10c+a(k、a为常数) 与标准青霉素液相比较，可求得青霉素浓度。测定链霉素时用枯草菌，氯霉素用大肠菌，四环素用八连球菌作繁殖试验。此外还有用圆形滤纸代替圆筒，使被检液渗入的滤纸法。微生物学测定法原理和操作简单，目前在抗微生物药物残留的快速分析中仍发挥作用，但不能准确定量。
      4.其他快速检测方法
      针对蜂蜜中抗生素、农药残留等安全问题，一些快速检测方法应运而生，比如采用间接竞争的酶联免疫试剂盒法、胶体金试纸条法等。这些方法检测速度快、成本低、便于操作，可用于现场执法，也可用于大规模筛选。因此，快速检测方法是上述国标方法的有益补充。
转载自中国计量网