黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌毒素代谢产生的一类有毒的真菌毒素，广泛存在于各种食品、农产品和饲料中，甚至坚果、乳制品、调味品等一些常见食品中也能经常发现黄曲霉毒素［1］。黄曲霉毒素具有极强的毒性和致癌性，可引发动物的肝癌、肾癌、胃癌等，其中黄曲霉毒素B1的毒性是氰化钾的10倍，被确认为Ⅰ类致癌物［2］。我国对部分食品中黄曲霉毒素B1的限量标准：稻谷、大米、糙米不大于10μg／kg；豆类及其制品不大于5.0μg／kg；花生及其制品不大于10μg／kg；植物油脂(花生油、玉米油除外)不大于10μg／kg［3］。目前我国发布的国家标准黄曲霉毒素B1分析方法一般采用薄层色谱法、微柱筛选法、酶联免疫法、荧光光度法、液相色谱法等［4–6］。微柱筛选法、荧光光度法普及率较低；薄层色谱法操作繁琐费时，误差较大；酶联免疫法往往作为定性方法，检测结果重复性差；液相色谱法采用衍生液衍生化法，衍生液对存放时间和环境都有要求且毒性较大，操作性差。笔者采用光化学柱后衍生器对黄曲霉毒素B1进行衍生，不需使用化学物质，不需冲洗步骤，没有腐蚀性酸通过仪器，可延长液相色谱柱的使用寿命。该方法参加并通过了2012年度山西出入境检验检疫局组织的“食用油分析能力验证计划”，表明该方法可灵敏、准确地对食品中黄曲霉毒素B1的含量进行检测。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

液相色谱仪：HITACHIL–2000型、配L–2485荧光检测器、在线脱气机、柱温箱，上海天美科学仪器有限公司；光化学衍生反应器：PriboFastKRC–25型，北京泰乐琪生物科技有限公司；高速均质器：T8型，转速为5000～25000r／min，德国IKA公司；甲醇：色谱纯；实验用水：屈臣氏蒸馏水；PBS缓冲液：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用990mL水溶解，用浓盐酸调至pH7.0，最后用水定容至1000mL；吐温20–PBS缓冲液：取1.0mL吐温20，加入PBS缓冲液定容至1000mL；黄曲霉毒素B1标准物质：100μg／mL(乙腈基质)，北京泰乐琪生物科技有限公司；黄曲霉毒素B1免疫亲和层析柱：PribofastCA–010–3mL型，北京泰乐琪生物科技有限公司。

1.2液相色谱条件

色谱柱：LachromC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇–水(体积比为45∶55)，流量为0.8mL／min；柱温：25℃；激发波长：360nm；发射波长：420nm；进样体积：20μL。

1.3样品处理

如果是固体样品，称取(15.00±0.01)g粉碎的样品；如果是油脂则直接取样，无需处理。本次试验采用的是市售大豆植物油。准确加入125.0mL提取液甲醇–水溶液(体积比为70∶30)及5.0g氯化钠，以均质器高速搅拌2～3min后以4000r／min离心5min(或用槽纹滤纸过滤)，取15mL滤液加入30mL水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤，收集全部滤液。

1.4免疫亲和柱净化

准确移取15.0mL滤液注入免疫亲和柱，调节流速约1～2滴／s，待溶液完全流出后，分别用10.0mL的吐温–PBS缓冲液和纯水以约2～3滴／s流速清洗免疫亲和柱，弃去全部流出液。用甲醇以1～2滴／s流速慢慢洗脱免疫亲和柱中待测物质，收集全部洗脱液并定容至2.0mL，待测。

1.5实验步骤

1.5.1标准溶液的制备

准确移取0.5mL黄曲霉毒素B1标准物质，用流动相定容至100.0mL，配制成质量浓度为500ng／mL的标准储备液，再将其用流动相逐级稀释，配制成黄曲霉毒素B1质量浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0ng／mL的系列标准工作溶液。

1.5.2样品测定

于开机前10min打开光化学衍生反应器，色谱仪按1.2色谱条件稳定后，分别取处理后的样液和系列标准工作溶液各20μL进行测定，以色谱峰面积积分，绘制标准曲线。

2结果与讨论

2.1样品的前处理

黄曲霉毒素B1易溶于甲醇，因此采用甲醇–水溶液作为提取溶剂，能够提高黄曲霉毒素B1的溶出率。免疫亲和柱的高选择性使样品处理大为简化，提取液用水稀释的目的是减少甲醇对免疫亲和柱的亲和力的干扰，样液过柱后用纯水淋洗是为了去除非特异性杂质［7］。同时对比了Pribofast亲和柱和Aflatest亲和柱，结果无明显差异，本实验选择Pribofast亲和柱。对样品进行衍生化的目的是为了增强黄曲霉毒素B1的荧光性，分为柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生主要是采用试剂衍生，毒性大，不易保存，本试验采用柱后光化学衍生法简单易行，无污染。

2.2色谱条件的选择

黄曲霉毒素B1属于中等极性化合物，为了有利于色谱峰的分离和峰形的改善，分别采用DiamonsilC18和LachromC18色谱柱进行试验，在优化色谱条件过程中，分别使用了乙腈–水(体积比为30∶70)、甲醇–水(体积比为45∶55)两种体系的流动相，发现LachromC18色谱柱和甲醇–水(体积为45∶55)的流动相能够得到更好的峰形和响应值，同时降低了检测成本。流量设定为0.8mL／min是因为流速过大、压力过高会缩短柱后光化学衍生器的使用寿命。优化条件后，样品的峰形尖锐、对称，分离效果较好。食用油添加黄曲霉毒素B1样品色谱图见图1。

2.3线性范围和检出限

以响应信号即峰面积y为纵坐标，黄曲霉毒素B1溶液的质量浓度x为横坐标进行线性回归。实验表明，黄曲霉毒素B1溶液的质量浓度在1.0～20.0ng／mL范围内得线性方程为y=151100x–10290，相关系数r=0.9998。将标准品溶液稀释进样，以响应值3倍基线噪声对应的黄曲霉毒素B1浓度计算得检出限为0.1μg／kg，比GB／T18979–2003标准中

高效液相色谱法规定的1μg／kg的检出限提高一个

数量级。

2.4回收试验和精密度试验

为验证方法的准确性和可靠性，采用在空白样品中添加标准溶液的方法进行回收试验，3个质

量浓度添加水平分别为2，5，10ng／mL，同时每个质量浓度添加水平重复测定6次，加标回收和精密度试验结果见表1。由表1可知，平均回收率为88.5%～97.9%，测定结果的相对标准偏差小于3%，说明该方法具有较高的准确度和良好的精密度。

3结语

建立的荧光色谱–柱后光化学衍生测定食品中黄曲霉毒素B1的方法，减少了试剂污染，简化了样品处理过程，对黄曲霉毒素B1的检测具有较高的灵敏度，且方法的准确度和精密度均有很大

程度提高，适用于食品中黄曲霉毒素B1的分析检测。不足之处是出峰时间较长，导致样品检测时间较长，可以通过更换不同长度规格的光化学衍生反应器来进行改善。