薄层色谱的实验步骤有：点样、展开、定位(显色)、定性和定量。

1．薄层板制备

可以购买商品的预制板(有普通薄层板及高效薄层板)，也可以自行制备。制备方法是：将玻璃板裁成正方形或长方形，分析用为20cm×20cm和10cm×20cm；预试用为3cm×10cm和2.6cm×7.6cm(显微镜用载玻片)。将玻璃片洗净烘干。铺层方法有干法和湿法两种，现常用湿法，因为它具有薄层牢固、可批量制备、展开后便于保存、分离效果好等优点。

选用粒径为0.048～0.058mm (250～300目)的硅胶，加入羧甲基纤维素钠(CMC)或锻石膏(CaSO₄·1/2H₂O)为黏合剂(市售硅胶G是已加了12％～14％煅石膏的硅胶)，加入约3倍体积的水，调成糊状，倾倒在玻璃板上，轻轻颠动玻璃板，调好的硅胶自动淌成均匀薄层。也可用涂铺器铺层。根据用途薄层厚度可不同，一般分析用约为0.25mm，制备用约为1～3mm。涂铺好的薄层板在室温晾干后，根据活性要求在一定温度下加热活化后存于干燥器中备用。

市售的薄层用硅胶标有硅胶GF254和硅胶GF365，即为加有1.5%～2％荧光剂的荧光薄层板，用于在紫外光254nm或365nm照射定位用。在紫外光照射下，薄层板显荧光，样品斑点处不显荧光。

2．点样

样品制成溶液(溶剂最好选择与展开剂极性相似且易于挥发的有机溶剂)，浓度约0.5～2mg/mL。点样量为0.5～5 uL，在距底边1cm处点样，原点直径在3～4mm。手工点样用毛细管或微量注射器，如用点样仪点样，样量精确，形状整齐一致，能提高定量分析的准确度。

点样量与薄层性能、厚度及显色灵敏度有关，根据需要来具体确定。点样量太小，斑点不能显示，点样量太大，影响比移值和斑点形状。

3．展开

首先是选择展开剂，合适的分离体系是分离成功的关键，选择原则与经典柱色谱相同。合适的展开剂使组分展开后斑点清晰、集中、不拖尾，待测组分的Rf值最好为0.4～0.5。如待测组分较多，R_f值也可在0.25～0.75。可借鉴手册和文献及展开剂选择最佳化方法通过实验选择。

展开的实验操作是将点样后的薄层板置于密闭的层析槽中，下端浸入展开剂高度不应超过0.5cm。展开距离一般为10～15cm。根据溶剂移动的方向分为上行展开和下行展开。图8-18(a)是一种近水平上行展开槽。图8-18(b)是一种双底槽展开槽，节省溶剂且可方便地在另一底层中放展开剂或其它试剂，其蒸气可预饱和薄层板。

图8-18薄层展开槽

另外，还可利用多次展开、双向展开等方法得到不同的层析结果。

4．定位与显色

确定被分离组分的位置称为定位。展开后的薄层板自槽中取出，室温下挥发去溶剂。若被分离组分本身有颜色，它们的位置根据有色的斑点即可确定。无色的化合物可采用物理检出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射检出法来定位。

(1)物理检出法物理检出法属于非破坏性检出法。常用的有：

①紫外光有的化合物能吸收紫外光同时发出更长波长的光即荧光，可用此荧光定位。另一种方法是荧光消退技术，用有荧光剂的薄层板进行展开，于254nm或365nm荧光灯下观察，在波长230～390nm有吸收的化合物，在绿色的荧光背景上显暗紫色斑点。如化合物的紫外吸收较弱则检出不灵敏。

②碘多数有机化合物能吸附碘，使斑点呈淡黄色或褐色。此反应一般可逆，碘挥发后，组分又回到原来的状态。此法可在密闭容器中放几粒碘晶体或喷雾0.5％碘的三氯甲烷溶液。

③水憎水化合物在硅胶薄层展开后，可用水喷雾，对光观察，显示白色不透明的斑点。

(2)化学检出法化学检出法是使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有色化合物而定位。这种试剂叫显色剂。显色剂分为通用显色剂和专属性显色剂，表8-9列出部分通用显色剂，显色方式有喷雾法和浸渍法(必须硬板)。

表8-9部分通用显色剂

5．定性

①与已知的标准品在同一块薄层板上进行对照，若R_f值相同，可能为同一化合物。还需用几个薄层层析系统比较，组分与标准品的R_f值均一致，一般可认为是同一化合物。

②试样斑点与标准品的显色特性相同可帮助鉴定。

③斑点用光密度计原位扫描，得到吸收光谱或荧光光谱可用于定性。

④收集斑点，洗脱组分，用紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振等方法鉴定。

6．定量

样品组分经薄层分离后，可用以下两种方法定量：

①洗脱法把组分斑点位置的吸附剂取出，用溶剂洗脱后，用其它方法(如分光光度法、荧光等方法)测定。此法操作复杂，效率较低。

②原位法即在薄层上组分斑点位置进行测定。又可分为目测法、测面积法和薄层扫描仪扫描定量法。

目测法即是用肉眼观察斑点的大小和颜色的深浅，与一系列不同浓度的标准品斑点相比较。此法可用于粗略定量和限界分析。用测面仪可画下斑点面积进行定量分析。这两种方法都是较粗略的定量方法。薄层扫描定量法是采用仪器方法，直接测定薄层上斑点的吸光度或其它性质，绘制薄层色谱图，给出组分的峰面积，进行定量分析。

薄层色谱用于定量分析时，最好采用高效薄层色谱法，即采用分离效率高，展开距离短，灵敏度高的高效薄层板。且点样、展开、显色、定量均使用仪器。高效薄层色谱法的应用大大提高了薄层分析的重现性和准确度。