1．解联立方程法

当几个组分吸收曲线互不重叠时，与单一组分测定相同。在不同组分的各自最大吸收波长绘制标准曲线，测定吸光度A，确定组分含量。波长选取方法见图5-16。

当组分吸收曲线部分重叠时，根据吸光度的加和性A=A₁+A₂+…+A_n，当一束平行的某一波长单色光通过多组分体系时，若各组分吸光质点彼此不发生作用，但均对该波长单色光有吸收作用，则总的吸光度等于各组分吸光度总和，见图5-17。

图5-16x和y两组分吸收光谱不重叠

图5-17 x和y两组分吸收光谱重叠

例邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯四种组分在环己烷混合液中吸收光谱的吸收峰分别为745.2nm、768.0nm、741.2nm、696.3nm。四个波长下所测吸光度值为0.7721、0.8676、2.2036、0.7386、b=2cm，如表5-5所列。

表5-5四种苯衍生物的吸光度值

根据吸光度加和性：

用矩阵法可解出四种组分含量。

c₁=0.252g/50mL(对二甲苯)        c₃=0.406g/50mL(邻二甲苯)

c₂=0.277g/50mL(间二甲苯)        c₄=0.415g/50mL(乙基苯)

应用计算机程序解这类方程极为简便。新型的微机控制的分光光度计一般均提供这种程序软件，并自动报出结果。

2．双波长分光光度法

用经典的分光光度法测定混合物中多组分的含量，手续繁杂且误差较大。对于浑浊样品或背景吸收大的样品，有时很难找到合适的参比溶液，采用双波长分光光度法可以在一定范围内解决这一问题。

双波长分光光度法只使用一个吸收池，以样品溶液本身做参比，用两束波长为λ₁和λ₂的单色光交替照射到同一样品池，由检测器测量和记录样品溶液对波长λ₁和λ₂两束光的吸光度差值△A，由此求出待测组分的含量。

设两束单色入射光辐射功率相等，背景吸收也相等，据比尔定律有：

△A=A_λ2-A_λ1＝(ε_λ2-ε_λ1)cb

上式表明，在两波长处测得的吸光度差值△A与溶液中待测物的浓度c成正比。这就是双波长分光光度法定量分析的依据，该方法可用于样品溶液中单组分和多组分的测定。

应用双波长分光光度法，只要λ₁-λ₂波长组合选择适当，可以免去数学计算，在互有干扰的双组分体系中测定各成分的含量。λ₁-λ₂波长组合选择常用的方法有等吸收点法和系数倍率法，这里仅介绍等吸收点法。

单组分测定，可以有下列三种波长组合λ₁-λ₂的选择方法：

①λ₁为等吸收点的波长，λ₂为被测物最大吸收波长；

②λ₁为吸收曲线下端的某一波长，λ₂为被测物最大吸收波长；

③λ₁为试剂的最大吸收波长，λ₂为有色络合物的最大吸收波长。

混合组分时，波长组合λ₁-λ₂的选择方法，在此仅讨论双组分混合物吸收光谱相互重叠的情况。此时要求干扰组分在波长λ₁和λ₂处有相同的吸光度，这样，△A只与一个组分的浓度成正比；另外要求待测组分在此两波长处的吸光度差值应足够大，以保证较高的灵敏度。

下面以阿司匹林和水杨酸混合物中测定水杨酸含量为例说明波长组合的选择方法。

首先分别绘制阿司匹林和水杨酸标准溶液的吸收光谱(图5-18)。

由图5-18可知，若选择水杨酸的最大吸收波长λ_max作为测量波长λ₂，就无法找到消除干扰物质吸收的另一波长λ₁，因此必须选择其它波长，如选282nm作为λ₂，在282nm处作一垂线，与阿司匹林的吸收曲线相交在a点，作平行于横坐标的直线，与阿司匹林曲线相交在b点，由b点作垂线，与横坐标的相交点的波长即为λ₁，此时为261 nm，阿司匹林在λ₁处和λ₂处的吸收相等，其△A=0，因此△A只与水杨酸的浓度有关。

图5-18阿司匹林及水杨酸混合物双波长测定示意图
1-水杨酸；2-阿司匹林

△A与水杨酸的量有线性关系。

对于某些吸收曲线相似且严重重叠的体系，波长对仍不易选择，可用电子计算机来选择。

3.导数分光光度法

当样品中待测组分和干扰组分的吸收峰重叠且波长接近，干扰组分的吸收又很强时，待测组分的吸收峰只表现为肩峰，或两组分的吸收峰严重重叠。此时，双波长分光光度法也无法直接定量，而导数分光光度法可以简便、有效地解决这类问题。

导数分光光度法利用光吸收对波长的导数曲线来确定和分析吸收峰的位置和强度。

将朗伯-比尔定律A=εbc对波长进行一次微分，则一阶导数为：

由以上数学式可见，在一定条件下，各阶导数值与待测组分的浓度呈线性关系，这就是导数分光光度法定量分析的依据。

高斯型吸收光谱及一～四阶导数光谱如图5-19所示，零阶导数光谱(吸收光谱)的极大在奇数级的导数光谱中为零，在偶数级导数光谱中为极值，随着导数级数的增加，谱带数目增加，带宽减小，因而提高了光谱的分辨率。

图5-19吸收光谱与导数光谱的关系

用导数分光光度法进行定量分析的方法：在一定波长处，首先测定标准溶液的导数值，用导数值与对应的标准溶液浓度绘制标准曲线，在同一波长下测定样品溶液的导数值，根据标准曲线得出样品的浓度。

在实际工作中选用导数的最佳阶次，是根据实验来确定的，一般来说，基本光谱的极值在偶阶导数中最易辨认，拐点在奇阶导数中最易辨认。随着导数阶次的增加，导数光谱的复杂性随之增加，高阶导数光谱只在特殊情况下使用。

目前生产的带计算机的分光光度仪器一般能得到一～四阶导数光谱。

导数分光光度法的特点是能分辨两个或两个以上相互重叠的吸收峰，能分辨被掩盖的弱的吸收峰(肩峰)，消除浑浊背景的影响，提高测定的灵敏度和选择性。

相关链接：可见光吸收光谱法－定量测定