一、溶剂的纯化技术

在高效液相色谱分析中，正相色谱以己烷作为流动相主体，二氯甲烷、氯仿、乙醚作为改性剂；反相色谱以水作为流动相主体，以甲醇、乙腈、四氢呋喃作为改性剂。通常使用分析纯、优级纯试剂，可以满足高效液相色谱分析的要求，但为了防止微粒杂质堵塞流路或柱入口垫片，流动相都需用吼微孔玻璃漏斗过滤，或(最好)用0.45um的微孔滤膜过滤后再使用。

正相色谱中使用的己烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚中经常含微量的水分，其会改变液固色谱柱的分离性能，使用前应用球形分子筛柱脱去微量水分。

反相色谱中使用的甲醇、乙腈、四氢呋喃不必脱除微量水，但此时作为流动相主体的水，应使用高纯水或二次蒸馏水。甲醇、乙腈、四氢呋喃使用前最好经硅胶柱净化，除去具有紫外吸收的杂质，特别是乙腈纯度低时会对UVD产生严重干扰。四氢呋喃中含抗氧剂，且长期放置会产生易爆的过氧化物，使用前应用10％ KI溶液检验有无过氧化物(若有会生成黄色I₂)，最好使用新蒸馏出的四氢呋喃。

此外卤代烃中的杂质，如氯仿中可能会生成光气，二氯甲烷中含有氯化氢，都会对分离产生不良影响。

用作流动相的各种溶剂经纯化处理后，在储液罐中还必须经过超声或真空脱气，才能使用。

二、色谱柱的保护与再生技术

高效液相色谱柱填充了高效全多孔球形微粒固定相，并用高压匀浆法填充，其售价较贵，若使用不当，会出现柱理论塔板数下降、色谱峰形变坏、柱压力降增大、保留时间改变等不良现象，从而大大缩短色谱柱的使用寿命。

为了延长色谱柱的使用寿命，前面已经指出，应在分析柱前连接一个小体积的保护柱。保护柱内径2～3mm，长不超过3cm，与填充分析柱同样的固定相。保护柱使用得当，对分离无明显影响。

在色谱柱使用过程中，应避免突然变化的高压冲击，这往往由于进样阀缓慢转动，泵突然启动引起。

对硅胶基体的键合固定相，流动相的pH值应保持在2.5～7.0之间。具有极端值的流动相会溶解硅胶，而使键合相流失。

使用水溶性流动相时，为防止微生物繁殖引起柱阻塞，应加入0.01％的叠氮化钠，以抑制微生物的繁殖。对不洁净的样品，要使用0.45um滤膜过滤或经固相萃取器净化后再进样。

进行正式分析前，应先用10倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，以保持色谱柱处于平衡状态。当使用乙醇、异丙醇、乙酸等黏度大的流动相时，色谱柱的平衡时间要延长，甚至要加倍。

对反相C₁₈ 键合相柱，除去柱中含有的缓冲溶液盐类或水溶性物质时，不应使用纯水冲洗。因为C₁₈键合相像一条长链将硅胶黏结，当有有机溶剂存在时，其表面被流动相润湿，C₁₈长链完全展开，像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时，C₁₈键合相与其不浸润，键合相表面会塌陷，从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出，应使用含5％有机溶剂的水溶液冲洗，才可清除无机盐或水溶性物质。

硅胶、氧化铝或正相键合相柱，应保存在流动相中。氰基柱不能保存在纯有机溶剂(如甲醇或乙腈)中，应保留在欲使用的流动相中；氨基柱最好保存在乙腈中，而非流动相，并且应注意不可使用丙酮作流动相。C₁₈反相柱应保存在纯甲醇溶剂中，对填充高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球的非极性固定相也可用此法保存。

对使用时间较长、柱效逐渐下降的色谱柱，可用下述方法进行快速再生，以除去微量不洁杂质在柱头的聚积。

正相柱：用下述极性强且能互溶的有机溶剂来洗涤色谱柱，每种溶剂每次用30mL清洗，按庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5％甲醇水溶液次序冲洗(洗脱剂的极性依次递增)，最后再用纯甲醇通过柱将水分带出，拆下柱置于气相色谱仪柱箱中升温至75℃，以除去水分。另应注意不能使用乙醇，它会使柱丧失柱效。

反相柱：用极性溶剂每种30mL，按以下顺序清洗：5％甲醇水溶液、0.5mol/L H₃PO₄(或0.1mol/L EDTA钠盐)、5％甲醇水溶液、甲醇、甲醇-氯仿(1：1)混合液、甲醇、5％甲醇水溶液。最后保存在甲醇溶剂中。

当色谱柱的性能变得很差时，可采用下述两种方法，作最后的补救。

一种方法是修补柱头并同时更换不锈钢烧结片。当取下烧结片发现柱头塌陷或填料被杂质污染时，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同样的干燥固定相，用少量流动相润湿，再填充干燥的固定相与柱口平齐(必要时用光滑的不锈钢棒压紧)，如此重复3～5次。再换上新的不锈钢烧结过滤片，拧紧结头，与高压泵连接，用流动相冲洗20min，若柱压力降恢复正常，可连接检测器，测柱效。若柱效恢复就可继续使用。若柱压力降恢复正常，但柱效仍偏低，表明柱头未填充紧密，仍有空隙，此时应重复上述操作，直至柱压力降恢复正常、柱效也恢复正常才可继续使用。

另一种方法是倒冲色谱柱。此法适用于已修补过柱头，柱寿命已达中后期的色谱柱。柱逆向使用后柱效会损失较大(约30％)，倒冲柱可检查柱头不锈钢烧结片是否堵塞。若已堵塞在倒冲柱时，可观察到柱压力降减小，待柱压力降恢复正常，再将色谱柱按原方向安装使用。

上述最后的补救方法不一定有实效，但从积累实践工作经验、节约分析成本考虑，还是值得一试的。

相关链接：高效液相色谱操作条件的优化