3.梯度洗脱的方法

(1)二元溶剂梯度洗脱二元溶剂的梯度洗脱经常使用一个弱极性溶剂A和一个强极性溶剂B进行组合构成流动相。当以梯度洗脱时间(t)作横坐标，以流动相中强极性溶剂B的体积百分含量(φ_B)作纵坐标时，可绘制出梯度洗脱曲线。若在单位时间内，强极性溶剂B在流动相中的体积百分含量，以恒定速率增加，则流动相的极性呈“线性梯度”输出；若不以恒定速率增加，则流动相的极性呈“非线性梯度”输出，即以“指数形式”呈现凸形或凹形输出(图9-66)。

当梯度洗脱方式确定后，对应于不同梯度洗脱形状，获得的色谱分离图如图9-67所示。图9-67 (b)所示为呈线性梯度洗脱，谱图中每个组分谱带宽度相等，各谱带间具有相同的分离度。图9-67(a)所示为呈“指数形式”的凸形洗脱，在分离开始时，B溶剂的体积百分含量迅速增加，使各组分谱带以较低的平均容量因子'值洗脱，并且最终谱带的k'值也较低，使开始被洗脱组分的色谱峰形尖锐，分离度较小；而在分离的后期，B溶剂的体积百分含量增长减慢，使后被洗脱组分色谱峰形加宽，分离度增大。图9-67 (c)所示为呈“指数形式”的凹形洗脱，其谱图变化与图9-67 (a)恰好相反，即开始被洗脱的色谱峰形较宽，分离度较好，而后被洗脱的色谱峰形较尖锐，分离度减小。由上述可知，当以“线性梯度梦输出时可获较理想的分离效果。

图9-66  梯度洗脱形状

图9-67  梯度曲线的形状及对分离的影响
(a)凸形；(b)线形；(c)凹形

(2)三元溶剂梯度洗脱三元溶剂的梯度洗脱，常以一种溶剂A(如水)作为流动相的主体，另选两种改性剂B和C(如甲醇和乙腈)来改变流动相的组成，并调节流动相的极性和洗脱强度。

三元溶剂梯度洗脱形状可用一个三棱镜体形式的图形表示，如图9-68所示。此三棱镜体的前面为△ABC，后面为△A'B'C'，底面为长方形BCC'B'，两个侧面分别为长方形ABB'A'和ACC'A'。

图9-68  三元溶剂梯度洗脱的图示

若以△ABC的3个顶点，A表示流动相主体的水，B、C分别表示加入的改性剂甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)，则A、B、C三点的组成和极性参数分别为

A：H₂O 100％；P'＝10.2

B：MeOH 100％；P'＝5.1

C：ACN 100％；P'＝5.8

显然图中AA"、BB'、CC'3条直线都具有各自的极性参数，且每条线上的各点P'值相同，这三条线的长度相等，且可作为梯度洗脱的时间坐标(t)。

在△ABC的3个边AB、BC、CA，除3个顶点外，这些边上的每一点都代表一种二元混合溶剂。下面以3个边的中间点E、F、G为例，来确定它们的组成和极性参数。

E：H₂O 50％，McOH 50％；P'＝10.2×50％＋5.1×50％＝5.10＋2.55＝7.65

F：MeOH 50％，ACN 50％；P'＝5.1×50％＋5.8×50％＝2.55＋2.90＝5.45

G：ACN 50％，H₂O 50％；P'=5.8×50％＋10.2×50％＝2.90＋5.10＝8.00

在△ABC平面内，除3个顶点外，面上的任何一点都代表一种三元混合溶剂。以H点，即此平面的中心点为例，来确定它的组成和极性参数。

H：H₂O 33.3％，MeOH 33.3％，ACN 33.3％；

P'＝10.2×33.3％＋5.1×33.3％+5.8×33.3％＝3. 40＋1.70＋1.90= 7.03

显然在三棱镜体内(6个端点和3条边除外)的任何一点也和△ABC面上的任何点(3个顶点除外)一样，也代表一种三元混合溶剂。下面以三棱镜体长度50％处中间截面上的H'点为例，来确定它的组成和极性参数。

由图9-68中可看出H'和H在同一条直线上，其组成和极性参数与H相同，即

H'：H₂O 33.3％，MeOH 33.3％，ACN 33.3％；P'＝7.03

如果以两阶线性梯度进行三元溶剂梯度洗脱，即从图中A点起始，经过H'点，最后达F'点，则与此3点对应的流动相组成和极性参数如下：

随洗脱时间的进行，混合溶剂组成变化如下：

相关链接：高效液相色谱法的实验技术－梯度洗脱技术（一）