能正确运用发酵法、滤膜法正确进行总大肠菌群的测定；熟练掌握用滤膜法测定饮用水中总大肠菌群的方法、步骤和要点；了解发酵法测定水源水总大肠菌群的方法、步骤和要点。

一、乳糖蛋白陈培养液(供大肠杆菌发酵试验用)

称取：蛋白陈2.5g，牛肉膏0.75g、NaC11.25g、乳糖1.25g，1.6％溴甲酚紫乙醇溶液0.25ml，蒸馏水250ml于500ml烧杯中溶解，混匀，加10％ NaOH，调pH=7.2～7.4，分装于装有试管的倒管中，在115℃条件下，灭菌15min。

二、品红亚硫酸钠培养基(供大肠杆菌滤膜法试验用)

称取：蛋白胨2.5g，牛肉膏0.75g，NaCl1.25g，酵母浸膏，K₂HPO₄于500ml烧杯中，加150ml蒸馏水溶解，另称取琼脂5g加100ml蒸馏水溶解，待全部溶解后，混匀，加10％NaOH，调pH=7.2～7.4，用棉花过滤，再加入乳糖2.5g，在115℃条件下，灭菌15min，同时，将5％碱性品红2.5ml，Na₂SO₃ 1.25g分别于二支试管中，加少许蒸馏水，水浴灭菌10min后，加入到已灭菌的培养基中混溶。浇平皿(培养基厚度2～3mm)二个备用。

三、仪器：

1．高压蒸汽灭菌器。

2．干热灭菌(烘箱)。

3．水浴隔热培养箱。

4．冰箱。

5．显微镜。

6．培养皿(直径9ml)。

7．吸管(10.0ml、1.0ml)。

8．无齿镊子，抽滤设备、滤膜。

9．接种针(环)、载玻片。

10．试管、发酵管。

[任务实施]

一、发酵法

发酵法是测定大肠菌群的基本方法。此法按下列步骤进行：初发酵→平板分离→涂片、染色、镜检→复发酵。

1．初步发酵试验：本试验是将水样置于糖类液体培养基中，在一定温度下，经一定时间培养后，观察有无酸和气体产生(即有无发酵)，初步确定有无大肠菌群存在。如采用含有葡萄糖或甘露醇的培养液，则包括副大肠菌群；如不考虑副大肠菌群，则用乳糖蛋白胨培养液。由于水中除大肠菌群外，还可能存在其他发酵糖类物质的细菌，所以培
养后如发现气体和酸并不一定能肯定水中含有大肠菌群，还需根据这类细菌的其他特性进行下两阶段的检验，水中能使糖类发酵的细菌除大肠菌群外，最常见的有各种厌氧和好氧的芽抱杆菌。在被粪便严重污染的水中，这类细菌的数量比大肠菌群的数量要少得多。在此情形下，本阶段的发酵一般即可被认为确有大肠菌群存在。在比较清洁的或加氯的水中，由于芽抱的抵抗力较大，其数量可能相对地比较多，所以本试验即使产酸产气，还不能肯定是由于大肠菌群引起的，必须继续进行试验。

2．平板分离：这一阶段的检验主要是根据大肠菌群在固体培养基上可以在空气中生长，革兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性来进行的。在此阶段，可先将上一试验产酸产气的菌种移植于品红亚硫酸钠培养基(运藤氏培养基)或伊红美蓝培养基表面，这一步骤可以阻止厌氧芽孢杆菌的生长，而上述培养基所含染料物质也有抑制许多其他细菌生长繁殖的作用。经过培养，如果出现典型的大肠菌群菌落，则可认为有此类细菌存在。但为了作进一步的肯定，应进行革兰氏染色检验。由于芽孢杆菌经革兰氏染色后一般呈阳性，所以根据染色结果，又可将大肠菌群与好氧芽孢杆菌区别开来。如果革兰氏染色检验发现有阴性无芽孢杆菌存在，则为了更进一步的验证，可作复发酵试验。

3．复发酵试验：本试验是将可疑的菌落再移植于糖类培养基中，观察其是否发酵，是否产酸产气而最后肯定有无大肠菌群存在。

对于自来水厂出厂水，初发酵试验一般都在10个小发酵管和2个大发酵管(或发酵瓶)内进行，复发酵试验则在小发酵管内进行。

根据肯定有大肠菌群存在的初步发酵试验的发酵管或瓶的数目及试验所用的水样量，即可利用数理统计原理，算出每升水样中大肠菌群的最可能数目(MPN)，结果有专用图表可以查阅。

二、滤膜法

用发酵法完成全部检验约需72h。为了缩短检验时间，可以采用滤膜法。用这种方法检验大肠菌群，有可能在18h后完成。

滤膜法中常用的滤膜是一种多孔性硝化纤维薄膜。圆形滤膜直径一般为35mm，厚0.1mm。滤膜中小孔的直径平均为0.2um。

滤膜法的主要步骤如下：

1．将滤膜装在滤器上，用抽滤法过滤定量(333ml)水样，将细菌截留在滤膜表面。

2．将此滤膜的没有细菌的一面贴在品红亚硫酸钠培养基上(截留面向上)，以培育和获得单个菌落。

3．将滤膜上符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。大肠菌群菌落特征的菌落：①紫红色，具有金属光泽；②深红色，不带或略带金属光泽；③淡红色，中心色较深。

4．将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌，接种到乳糖蛋白胨培养液中，根据产气、产酸与否，来判断有无大肠菌群存在。

5．根据滤膜上生长的大肠菌群菌落数和过滤的水样体积，1升水样中大肠菌群数等于滤膜上产生并被证实的大肠菌群数×3；即可算出每升水样中的大肠菌群数。

6．空白试验：品红亚硫酸钠培养基上贴上已灭菌的滤膜，经培养后应该无细菌生长。

7．对照试验：①水中加入少量源水或大肠菌菌液，过滤后培养，应有三种特征菌落；②在滤膜上直接加源水1～2滴或大肠菌菌液1滴，不经过过滤，置于品红亚硫酸钠培养基上，应有三种特征菌落。

8．镜检原则：①三色菌菌落数不超过5个，应全部染色、镜检；②三色菌菌落数超过5个，应不低于5个染色、镜检。

三、注意事项

1．品红亚硫酸钠培养基在冰箱中保存一般不超过一周。

2.滤膜法比发酵法的检验时间短，但仍不能及时指导生产。当发现水质有问题时，这种不符合标准的水已进入管网一段时间了。此外，当水样中悬浮物较多时，悬浮物会沉积在滤膜上，影响细菌的发育，使测定结果不准确。目前以大肠菌群作为检验指标，只间接反映出生活饮用水被肠道病原菌污染的情况，而不能反映出水中是否传染性病毒以及除肠道病原菌外的其他病原菌(如炭疽杆菌)。因此为了保证人民的健康，必须加强检验水中病原微生物的研究工作。