一般情况下，HPLC分离方法的建立遵循以下步骤：

(1)了解样品的基本情况

所谓样品的基本情况，主要包括样品所含化合物的数目、种类(官能团)、分子量、pKa值、UV光谱图以及样品基体的性质(溶剂、填充物等)、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。

(2)明确分离目的

①是分析组分还是制备样品；

②是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析；

③是否有必要解析出样品的所有成分(比如对映体、非对映体、同系物、痕量杂质)；

④如需做定量分析，精密度需多高；

⑤建立的方法将适用几种样品分析还是许多种样品分析；

⑥将使用最终方法的常规实验室中已有哪些HPLC设备和技术。

(3)了解样品的性质和需要的预处理

除非样品是适于直接进样的溶液，否则，高效液相色谱分离前均需进行某种形式的预处理。有的样品需加入缓冲溶液以调节pH值；有的样品含有干扰物质或“损柱剂”而必须将其去除。此外，为了保证最终的样品溶液与流动相的成分尽量相近，最好用流动相溶解(或稀释)样品。

(4)检测器的选择

不同的分离目的对检测的要求不同，如测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰。另外，如果目的是定性分析或是制备色谱，则最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分。仪对分析而言，检测器灵敏度越高，最低检出量越小越好；如果目的是用作制备分离，则检测器的灵敏度没必要很高。

应尽量使用紫外检测器(UV)，因为目前一般的HPLC都配有这类检测器，它方便且受外界影响小。如被测化合物没有足够的UV生色团，则应考虑使用其他检测手段：
如示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器等。如果实在找不到合适的检测器，才可以考虑将样品衍生化为有UV吸收或有荧光的产物，然后再用UV或荧光检测。

(5)分离模式的选择

在充分考虑样品的溶解度、分子量、分子结构和极性差异的基础上，确定HPLC的分离模式。

(6)固定相和流动相的选择

在实际分析过程中，确立了分离模式之后，选择合适的固定相与流动相是十分重要的。下面简单讨论几种常见液相色谱法的固定相与流动相的选择。

A．硅胶吸附色谱

在硅胶吸附色谱中，对保留值和选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用，流动相的作用主要是调节溶质的保留值在一定范围内。在吸附色谱中，流动相的弱组分是正己烷，实际过程中，可根据溶质所包含的官能团信息，选择适当的流动相的强组分。

①样品中只含有一OH、 COOH、--NH₂这类质子给予体基团时，可选用异丙醇作为流动相的强组分；

②样品中的溶质中含有一C00一、一CO一、 N0₂一和一C=O这类质子接受体的基团时，可选用乙酸乙酯、丙酮或乙腈作为流动相的强组分；

③样品的溶质中只含有一0一和苯基这类极性作用较弱的基团时，可选用乙醚作为冲洗剂的强组分；

④样品中若含有规则①、②和③中两种或两种以上不同类的基团时，可按规则①、②和③的顺序优先选择冲洗剂的强组分；

⑤样品中的溶质同时含有多个一H₂PO₄、--COOH、--OH和一NH₂等氢键力较强的基团时，则应在规则①选择的流动相中加入适量的乙醇或乙腈，必要时也可加入水。

B．正相键合相色谱

正相键合相色谱分离机理与硅胶吸附色谱相似，流动相的选择可引用硅胶吸附色谱中的规则，固定相的选择原则如下：

①若-样品溶质中含有一COO一、-NO₂、-CN等具有质子接受体基团，则可选用氨基、二醇基这一类具有质子给予能力的固定相；

②若样品溶质中含有NH₂、NH、OH、一COOH等具有质子给予能力的基团，则可选用腈基、氨基和醇基键合固定相；

③若样品中同时包含有规则①与②中所示的两类基团，则可选用规则①中推荐的键合同定相。

C．反相色谱

在反相色谱中，水是常用的流动相，C18是常用的填充载体。重要的是选择流动相的强组分，常用的强组分有甲醇、乙腈与四氢呋喃。反相色谱流动相的选择规则如下：

①若样品溶质中含有两个以下氢键作用基团(如--COOH、--NH₂、--OH等)的芳香烃邻、对位或邻、间位异构体，可选用甲醇／水为流动相;

②若样品溶质中含有两个以上C1、I、Br的邻、间、对位异构体或极性取代基的间、对位异构体以及双键位置不同的异构体，可选用苯基或C18键合固定相、乙腈／水为流动相；

③当实际过程中获得溶质的k值大于30(一般要求1<k’<20时)，应在反相色谱系统的甲醇／水流动相中加入适量四氢呋喃、三氯甲烷或丙酮，以使被分离溶质的K’值保持在适当范围内；当然，也可以通过减少固定相表面键合碳链浓度或缩短碳链长度来达到减小k值的目的；

④若样品溶质中含有一NH₂、NH或N一这一类基团时，应在反相色谱的流动相中加入适量有机胺以提高样品保留值的重现性和色谱峰的对称性。

D．凝胶色谱

凝胶是凝胶色谱的核心，是产生分离作用的基础，进行凝胶色谱实验的重要一环是选择和搭配具有不同孔径的性能良好的凝胶。生物大分子分离的传统方法多采用多糖聚合物凝胶GPC填料，这种填料只能在低压、慢速操作条件下使用，目前在很大程度上已被微粒型交联亲水硅胶和亲水性键合硅胶取代。填料具有一定的孔径尺寸分布，随孔径大小的差别，分离分子量范围为1—200万之间。对于实验室分析或小规模制备，平均粒度在3～13μm的填料，一般有良好的柱效和分离能力；但对于大规模制备和纯化，考虑到成本和渗透性，可选用较粗的粒度。实际过程中，往往实验室只配备有一定的色谱柱，因此，色谱分离方法和色谱柱往往是确定的，但对装备齐全的实验室而青，色谱柱的选择还是有意义的。