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平板电泳常用方法——区带电泳法

发布时间:2014-07-09 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1205

l.纸电泳法

纸电泳是以滤纸为支持介质的区带电泳,早期的纸电泳,用于血清蛋白分离,但因其分辨较差,且有吸附,现已被其他电泳取代。目前主要用于混合核苷酸的分离和含量测定。

(1)仪器装置

包括电泳室及直流电源两部分。

常用的水平式电泳室装置,包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两部分;外格装有铂电极(直径0.5~O.8cm)D;里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出;两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。电源为具有稳匿器的直流电源。

(2)操作法

①电泳缓冲液 取枸橼酸39.04g与枸橼酸钠4.12g,加水4000ml,使溶解。

②滤纸 取色谱滤纸置Imol/L甲酸溶液中浸泡过夜,取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端5—8cm处划一起始线,每隔2.5~3cm处做一记号备点样用。

③点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点10μl,共3点,并留2个空白位置。

干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处最后喷湿,本法适用于稀的供试品溶液。

④电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。

⑤含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分别置试管中,各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。


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