环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)是一种水溶性、高甜度的非营养型合成甜味剂。甜蜜素在我国广泛用于食品加工行业，但其超量、超范围使用现象严重。从化学结构来看，甜蜜素能在生物体内经水解形成毒性更强的环己基胺，环己基胺是一类亚胺化合物，具有一定的致癌性。因此过量摄入甜蜜素有致癌、致畸等副作用，许多国家禁止将甜蜜素作为食品添加剂。GB 2760–2011《食品添加剂使用卫生标准》及增补公告规定甜蜜素在冷冻饮品中的最大使用量为0.65 g／kg。目前测定甜蜜素的方法主要有气相色谱法、液相色谱串联质谱法等，但是气相色谱法检出限对于允许添加含量很低的样品或者不得添加的样品，不能满足分析要求，而且甜蜜素在酸性条件下用亚硝酸盐衍生的衍生物在常温下不稳定，影响测定结果，在测定白酒中的甜蜜素时有时出现假阳性。液相色谱串联质谱法无需衍生，检测灵敏度高，但是冷冻饮品无相应样品前处理过程，而LC–MS／MS易受基质干扰，存在离子抑制效应，导致检测结果不准确，若样品不加处理直接进样，易污染离子传输毛细管。冷冻饮品中含有过多的色素、脂肪和蛋白质，基质比较复杂，因此样品需经净化处理后才能进样。笔者采用乙酸锌和亚铁氰化钾除去蛋白质和脂肪净化样品，冷冻离心后定容测定。该方法准确度高，灵敏度好，检出限低，适合冷冻饮品等复杂基质样品的测定。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪：TSQ Quantum Ultra型，三重四极杆，美国Thermo Fisher Scientific公司；

环己氨基磺酸钠标准品：纯度不小于99.0%，德国Dr.公司；

电子天平：XP205型，感量为0.01，0.1 mg，瑞士梅特勒–托利多公司；

冷冻离心机：Vecocity 18RL型，澳大利亚Dynamica公司；

涡旋混匀器：IKA MS3 basic型，德国IKA公司；

匀浆机：JYL–A070型，九阳股份有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；

甲酸：纯度不小于98.0%，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

乙酸锌、亚铁氰化钾：分析纯，天津科密欧公司；

乙酸铵：纯度不小于99.0%，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

乙酸铵溶液：0.01 mol／L，称取0.77 g乙酸铵，加水溶解并定容至1 000 mL，混匀，过0.45 μm滤膜，备用；

亚铁氰化钾溶液：称取10.6 g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]加水定容至100 mL，混匀，配成92 g／L亚铁氰化钾溶液；乙酸锌溶液：称取22.0 g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]溶于少量水中，加入3 mL冰乙酸，加水稀释至100 mL，混匀，配成183 g／L乙酸锌溶液；

水系微孔过滤头：0.22 μm；实验室用水为纯净水。

1.2甜蜜素标准储备液

准确称取0.100 0 g环己氨基磺酸钠标准品于100 mL容量瓶中，用纯净水定容至刻度，混匀，得到浓度为1.000 g／L的甜蜜素标准储备液。

1.3仪器分析条件

1.3.1液相色谱条件

色谱柱：Syncronis C18 色谱柱(50 mm×2.1mm，1.7 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)；柱温：40℃；流速：300 μL／min；进样体积：5 μL；流动相：A为乙腈，B为0.01 mol／L乙酸铵，梯度洗脱条件见表1。

1.3.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)，见表2；ESI+喷雾电压：3 500 V；离子传输毛细管温度：350℃；蒸发温度：200℃；碰撞气压力(高纯氩气)：

1.4样品处理

取有代表性的样品，匀浆，混匀，作为试样。称取试样1.00 g，置于50 mL离心管中，加入10 mL水，混匀后，于超声清洗器中超声20 min，依次加入1 mL亚铁氰化钾溶液和1 mL乙酸锌溶液，涡旋混匀1 min，于4℃，8 000 r／min离心5 min，过滤并用水定容至25 mL，混匀，备用。若样品中甜蜜素含量过高，可以稀释10～20倍，即吸取5～10 mL用水定容100 mL，混匀，取部分过0.22 μm滤膜，供液相色谱–质谱／质谱仪测定。

1.5标准曲线的绘制

准确移取1.0 mL甜蜜素标准储备液于100 mL容量瓶中，用水定容至标线，混匀，得到浓度为10 mg／L的标准使用液，经逐级稀释得到浓度分别为2，5，10，20，50，100，200，500，1 000 μg／L的系列标准工作溶液。

1.6色谱图

按1.3仪器条件测定甜蜜素标准溶液，色谱图见图1。

2结果与讨论

2.1样品的前处理

采用两种前处理方法，第一法是称取试样1.00 g，加水10 mL，混匀后，超声20 min，4℃，8 000r／min冷冻离心5 min，过滤，用水稀释定容至25mL，过0.22 μm滤膜，供液相色谱–质谱／质谱仪测定；第二法如1.4所示。虽然第一法在谱图上显示杂质干扰不大，但是冷冻饮品中含有大量的色素、脂肪和蛋白质等物质在稀释后的样品中含量很高，若不经净化直接进入仪器，容易造成污染，而且易发生乳化现象，影响测定结果；而第二法中，亚铁氰化钾配合乙酸锌作为澄清剂，利用乙酸锌与亚铁氰化钾反应生成的氰亚铁酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质。这种澄清剂除蛋白质能力强，适用于蛋白质含量较高的样液的澄清，因此采用第二法。

2.2色谱条件的优化

比较了乙腈–0.01 mol／L乙酸铵缓冲溶液、乙腈–0.1%甲酸溶液、甲醇–0.1%甲酸溶液和甲醇–0.01 mol／L乙酸铵缓冲液4种流动相体系对甜蜜素分离的影响，结果见表3。从表3中色谱峰面积响应值来看，乙腈–0.1%甲酸溶液响应值最高，甲醇–0.1%甲酸溶液响应值次之，甲醇–0.01 mol／L乙酸铵溶液响应值最低。用乙腈–0.1%甲酸溶液和乙腈–0.01 mol／L乙酸铵溶液分别测定同一样品6次，两者的相对标准偏差分别为7.3%和1.2%，表明前者稳定性较差。综合保留时间和稳定性等各种因素，选择乙腈–0.01 mol／L乙酸铵缓冲溶液作流动相。

2.3线性范围和检出限

实验表明，在2～1 000 μg／L的质量浓度范围内以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，回归方程为Y=–684.315+354.246X，相关系数r2=0.999 9。以信噪比S／N≥10计算得方法的定量限为0.02 mg／kg，大大低于SN／T 1948–2007标准规定的测定低限0.1 mg／kg。

2.4回收试验

采用在样品中添加标准溶液的方法进行回收试验。随机抽取市售冷冻饮品进行加标回收试验，每一样品重复测定6次，结果见表4。

由表4可以看出，该方法测定的加标回收率为87.5%～101.8%，回收率的测定结果符合GB／T27404–2008中附录表F.1中的要求。

2.5精密度试验

随机抽取一冷冻样品按照1.5法进行处理，重复测定6次，测定结果126.89，134.63，133.85，135.44，137.75，129.14 μg ／L，平均值为132.95μg／L，相对标准偏差为3.0%，精密度测定结果符合GB／T 27404–2008中附录表F.2中的要求。

3结语

建立了冷冻饮品中甜蜜素的液相色谱串联质谱分析方法，该方法准确度高，灵敏度好，检出限低，适用于检验机构日常检验工作中冷冻饮品中甜蜜素含量的定性定量分析。

摘自化学分析计量网