五、维生素B₂(核黄素)的测定(荧光法)

1．原理

核黄素在440～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比，在波长525 nm下测定其荧光强度，试液再加入低亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。

2．试剂及设备

(1)试剂2.5 mol/L无水乙酸钠溶液，硅镁吸附剂(60～100目)，10％木瓜蛋白酶(用2.5 mol/L乙酸钠配制，使用时现配)，10％淀粉酶(用2.5mol/L乙酸钠配制，使用时现配)，0.1 mol/L盐酸，0.1mol/L NaOH，1mol/L NaOH, 20％低亚硫酸钠溶液(用时现配，保存于冰水浴中，4h内有效)，洗脱液(丙酮：冰乙酸：水=5:2:9),0.04%溴甲酚绿指示剂(称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4mL 0.1mol/L NaOH溶液研磨，加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL)，3 % KMnO₄溶液，3 % H₂O₂溶液。实验用水为蒸馏水，试剂不加说明为分析纯。

核黄素标准使用溶液：吸取2.00 mL核黄素标准储备液(25ug/mL)，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，避光，储于4℃冰箱，可保存1周，此溶液每毫升相当于1.00ug核黄素。

(2)设备实验室常用设备，高压消毒锅，电热恒温培养箱，核黄素吸附柱，荧光分光光度计。

3，检测步骤

(1)样品提取

①水解：称取2～10g样品(约含10～20ug核黄素)于100mL三角瓶中，加入50mL 0.1 mol/L的盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，103kPa 30min，水解液冷却后，滴加1 mol/LNaOH，取少许溶液，用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿色，pH4.5。

②酶解：a．含有淀粉的水解液：加入3 mL 10％淀粉酶溶液，于37～40℃保温约16h。

b．含高蛋白的水解液：加入3 mL 10％木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保温约16h。

③过滤：上述酶解液定容至100.0mL，用干滤纸过滤，此提取液在4℃冰箱中可保存一周。

(2)氧化去杂质取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液(约含1～10ug核黄素)分别于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL，各管加0.5 mL冰乙酸，加3 % KMnO₄溶液0.5 mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质，滴加3％双氧水溶液数滴，直至KMnO₄的颜色褪去，剧烈振摇试管，使多余的O₂逸出。

(3)吸附和洗脱

①核黄素吸附柱：硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱，占柱长1/2～2/3(约5cm)为宜，吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。

②过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用20mL热水洗去样品中的杂质。然后用5.00mL洗脱液将样品中的核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液体并定容至10mL,混匀后待测荧光。

(4)测定于激发光波长440 nm，发射光波长525 nm，测量样品管及标准管的荧光值，待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液(约5～7 mL)中加0.1 mL 20％的低亚硫酸钠溶液，立即摇匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。

4．结果计算

式中X—样品中核黄素的含量，mg/100g;

C—标准管荧光值；

A—样品管荧光值；

D—标准管空白荧光值；

B—样品管空白荧光值；

f—稀释倍数；

m—样品质量，g；

m'—标准管中的核黄素含量，ug;
—将样品中核黄素量由ug/g折算成ug/100g的折算系数。

5．说明

整个过程需避光进行；因核黄素在碱性溶液中不稳定，因而加NaOH时应边摇边加，防止局部碱度过大，破坏核黄素。

相关链接：维生素的测定（三）

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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