二、高效液相色谱法

高效液相色谱法适用于食品中没食子酸丙酯(PG)、2,4,5-三羟基苯丁酮(TH-BP)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA),2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT), 2,6-二叔丁基4-羟甲基苯酚(lonox100)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸十二酯(DG) 9种抗氧化剂的测定。

1.测定原理

油脂样品经有机溶剂溶解后，使用凝胶渗透色谱(GPC)净化；固体类食品样品用正己烷溶解，用乙腈提取，固相萃取柱净化。高效液相色谱法测定，外标法定量。

2．试剂和溶液

①甲酸(HCOOH)、乙腈(CH3CN)、甲醇(CH₃OH)、正己烷(C₆H₁₄，分析纯，重蒸)、乙酸乙酯(CH₃COOCH₂CH₃)、环己烷(C₆H₁₂)、氯化钠(NaCl，分析纯)。

②无水硫酸钠(Na₂SO₄)：分析纯，650℃灼烧4h,贮存于干燥器中，冷却后备用。

③乙腈饱和的正己烷溶液：正己烷中加入乙腈至饱和。

④正己烷饱和的乙腈溶液：乙腈中加入正己烷至饱和。

⑤乙酸乙酯和环己烷混合溶液(1+1)：取50mL乙酸乙酯和50mL环己烷混匀。

⑥乙腈和甲醇混合溶液(2+1)：取100mL乙腈和50 mL甲醇混合。

⑦饱和氯化钠溶液：水中加入氯化钠至饱和。

⑧甲酸溶液(0.1+99.9)：取0.1 mL甲酸移入100mL容量瓶，定容至刻度。

⑨抗氧化剂标准混合储备液：准确称取0.1g(精确至0.1 mg)上述9种抗氧化剂的标准品(纯度均≥98%)，用乙腈溶于100 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1000mg/L的标准混合储备液，0～4℃避光保存。

⑩抗氧化剂混合标准使用液：移取适量体积的浓度为1000mg/L的抗氧化剂标准混合储备液分别稀释至浓度为20、50、100、200、400mg/L的混合标准使用液。

3．仪器和设备

高效液相色谱仪；凝胶渗透色谱仪；离心机(转速≥3000r/min)；旋转蒸发仪、涡旋振荡器；分析天平：感量为0.01g和0.1mg；C₁₈固相萃取柱：2000mg/12mL ;有机系滤膜：孔径0.22um。

4．测定步骤

(1)取样和处理

①取样：固体或半固体样品粉碎混匀，然后用对角线法取四分之二或六分之二，或根据试样情况取有代表性试样，密封保存；液体样品混合均匀，取有代表性试样，密封保存。

②提取：固体类样品：称取1g(精确至0.01g)试样于50mL离心管中，加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液，涡旋1 min充分混匀，浸泡10 min。加入5mL饱和氯化钠溶液，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋2min, 3000r/min离心5 min，收集乙腈层于试管中，再重复使用5 mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，加0.1％甲酸溶液调节pH4,待净化。同时做空白试验。

油类样品：称取1g(精确至0.001g)试样于50mL离心管中，加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1 min，静置10min，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min,3000 r/min离心5 min，收集乙腈层于试管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待净化。同时做空白试验。

③净化：在C₁₈固相萃取柱中装入约2g的无水硫酸钠，用5 mL甲醇活化萃取柱，再以5mL乙腈平衡萃取柱，弃去流出液。将所有提取液倾入柱中，弃去流出液，再以5mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脱，收集所有洗脱液于试管中，40℃下旋转蒸发至干，加2mL乙腈定容，过0.22um有机系滤膜，待测。

④凝胶渗透色谱法处理：如果是纯油类样品可以选用凝胶渗透色谱法进行样品处理。

称取样品10g(精确至0.01g)于100mL容量瓶中，以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度，作为母液；取5mL母液于10mL容量瓶中以乙酸乙酯和环己烷混合溶液定容至刻度，待净化。

取10mL待测液加入凝胶渗透色谱(GPC)进样管中，使用GPC净化，收集流出液，40℃下旋转蒸发至干，加2mL乙腈定容，过0.22 um有机系滤膜，供液相色谱测定。同时做空白试验。

GPC净化条件：凝胶渗透色谱柱用300mm×20mm玻璃柱，BioBeads (S-X3)，40～75 um;柱分离度，玉米油与九种抗氧化剂的分离度＞85%；流动相为乙酸乙酯：环己烷＝1:1(体积比)；流速为5 mL/min；进样量为2mL；流出液收集时间为7～17.5 min;紫外检测器波长为280 nm。

(2)色谱参考条件

①色谱柱：C₁₈柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或等效色谱柱。

②流动相A; 0.5％甲酸水溶液，流动相B：甲醇；洗脱梯度：按表3-5进行。

表3-5 液相色谱洗脱梯度

③柱温：35℃；进样量：5uL；检测波长：280nm。

(3)标准曲线的制作将系列浓度的标准工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的抗氧化剂，以标准工作液的浓度为横坐标，以响应值(峰面积、峰高、吸收值等)为纵坐标，绘制标准曲线。

(4)样品测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到相应色谱峰的响应值，根据标准曲线得到待测液中抗氧化剂的浓度。

5．结果计算

式中X—试样中抗氧化剂含量，mg/kg;

ρ—从标准曲线上得到的抗氧化剂溶液浓度，ug/ mL ;

V—样液最终定容体积，mL ;

m—称取的试样质量，g。

结果保留三位有效数字(或保留到小数点后两位)。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

相关链接：食品抗氧化剂含量的测定（一）

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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