中国及东南亚各国利用烟熏、烧烤和油炸的方法加工食品的历史悠久，如：熏鱼、火腿、烤鱼片、炸油条等，特别是近些年来，烧烤肉制品备受人们的青睐。然而在熏烤食物的过程中，由于燃料的不完全燃烧产生了多环芳烃，使食物受到污染，同样在油炸食品时，如果油温超过200℃，并且油脂经多次反复加热使用，可使油炸食品中3,4-苯并芘的含量大大超过5ug/kg的食品卫生标准。3,4-苯并芘属多环芳烃类有机物，是目前世界上公认的强致癌、致畸物质之一。因此有必要检测这类物质在食品中的含量。

3,4-苯并芘的测定方法有薄层层析法，荧光分光光度法和高效液相色谱法。现介绍荧光分光光度法。

(一)检测原理

样品溶液经提取和分离柱净化后，用薄层层析法将3,4-苯并芘从多环芳烃类化合物中分离出来，然后从薄板上刮下含有3,4-苯并芘的部分，经乙醇溶出后，制备成待测溶液。利用3,4-苯并芘在紫外光照射下发射的荧光具有特征性吸收峰的特点，用荧光分光光度计测定其含量。

(二)试剂与仪器

1．试剂

①二甲基亚砜(简称DMSO)，使用时与水以9:1制成DMSO水溶液。二甲基甲酰胺(简称DMF)，使用时与水以9:1制成DMF水溶液。石油醚(沸程30～60℃)。无水硫酸钠(经550℃高温处理4h)。硅胶G(10～40 um颗粒)。

②有机试剂：乙醇、甲醇、己烷、环己烷、异辛烷、二氯甲烷、氯仿和苯(需经重蒸馏)。

③氢氧化钾、氢氧化钠、氯化钠、磷酸和乙酸酐，均为分析纯试剂。

④2%咖啡因水溶液：称取1g咖啡因，溶于50mL 50～60℃的蒸馏水中。

⑤硅镁型吸附剂(60～100目)：用四倍水洗涤四次后，在玻璃砂板漏斗中滤干，再用甲醇洗净，甲醇的使用量与吸附剂相同。抽干后，在130℃下于烘箱中干燥5h，随即装瓶贮存于干燥器中。临用前，加入5％的水以降低其活性，混匀后密闭平衡4h，备用。

⑥甘油淀粉润滑剂：将甘油与可溶性淀粉以33 : 9的质量比混合，微火加热搅拌至透明状，用作涂抹玻璃仪器活塞。

⑦苯并芘标准溶液：准确称取3,4-苯并芘纯品固体10.0mg，用异辛烷溶解后，转移到100 mL的棕色容量瓶中，稀释至刻度。此溶液为每毫升相当于100ug苯并芘的标准溶液。吸取此液1mL，用异辛烷准确稀释到10mL，即为每毫升相当于10ug的苯并芘标准溶液。使用时吸取此标准溶液1.0mL，用异辛烷再准确稀释100倍，即为每毫升相当于0.1ug苯并芘的标准工作液。

2．仪器与设备

①荧光分光光度计，具有双扫描功能。紫外灯(波长365nm , 125W)。K-D浓缩器或旋转蒸发器。低速离心机。

②层析柱：长约350mm,φ20mm，具有玻璃砂滤板和玻璃活塞。

③薄层层析用仪器：涂布器、玻璃板、层析缸、圆形标本缸、微量注射器、脂肪提取器、锥形瓶、10mL具塞离心试管和分液漏斗(500mL和1000 mL容量)。

(三)检测步骤

l．样品的制备

(1)粮食及其制品(包括大米、玉米、小麦、高粱等)经粉碎机粉碎后过40目筛，筛后混匀备用。

(2)鱼、肉及其烟熏制品取其可食部分，用绞肉机绞碎后备用。

(3)酒类酒类样品混合均匀后取样。啤酒先倒入大烧杯中，加温除去二氧化碳后取样。

2. 样品的提取

含脂肪的固体样品如鱼、肉、粮食等需先行皂化后提取。不含脂肪的样品，如酒类可不经皂化而直接进行液-液萃取。

(1)粮食及其制品称取均匀样品80.0g，装入滤纸筒内适当填紧。然后装入脂肪提取器内，加入70 mL石油醚润湿样品，连接冷凝器和脂肪瓶。脂肪瓶内预先装有氢氧化钾6g(高粱、玉米加入12g)、100 mL乙醇和60 mL石油醚，在70℃水浴上提取及皂化4～6h。然后将全部皂化提取液趁热滤入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚再次提取，弃去水层：合并两次石油醚提取液，用水洗涤，提取3次，每次150 mL。水洗时切勿用力过猛，以防止乳化。经水洗过的石油醚提取液通过无水硫酸钠柱脱水后，收集于250mL磨口锥形瓶中，用于下一步的净化操作。

(2)鱼、肉类及其熏制品称取搅碎均匀的可食部分样品50.0g，置干250mL脂肪瓶中，加入100 mL乙醇、12～15g氢氧化钾(如为干熟制品，则先用30 mL水调匀后，再加入乙醇和氢氧化钾)。然后在沸水浴中回流加热约3h，待肉样全部消化后，趁热通过铺有少量脱脂棉的漏斗滤入1000 mL分液漏斗中。再依次用50mL乙醇和150mL石油醚分2次洗涤脂肪瓶，洗涤液并入分液漏斗中。然后按粮食及其制品的样品提取方法进行提取，得到提取液，用于净化操作。

(3)酒类吸取100mL酒样(白酒可取50mL，另加50mL水)，注入500mL分液漏斗中，加入2g氯化钠，溶解后用环己烷提取2次，每次用50mL。将环己烷提取液用K-D浓缩器减压浓缩至溶液为20mL。将此浓缩液用二甲基亚砜水溶液在500mL分液漏斗中提取3次，每次用50mL。将提取液合并于另一个分液漏斗中，加入150mL冰水合剂，再以环己烷提取两次，每次用200 mL。合并环己烷提取液，进行减压浓缩至50mL以下时，再移入原分液漏斗中。以等量水洗涤三次，静置分层，弃去水层。环己烷提取液用于净化。

3．样品的净化

样品净化的目的是将苯并芘等多环芳烃类化合物和其他混杂物分离开来。一般根据样品性质选用液-液分配法或柱层析净化法，或者将两种方法结合起来进行净化。

柱层析净化，一般采用硅镁吸附剂或中性氧化铝硅胶吸附剂制备层析分离柱。硅镁吸附剂的层析分离柱的装填方法是将无水硫酸钠装填于层析柱的底部，高度大约为1cm，接着加入12g硅镁吸附剂，然后再加入10g无水硫酸钠。再将装有30g无水硫酸钠和脱脂棉的漏斗置于层析柱上端。装填试剂时，一定要边装边用橡皮锤轻敲管壁，操作完毕，先用30mL己烷润湿漏斗和层析柱。待多余的己烷流出后，将上述待净化的任一种样品提取液分别以2～3 mL/min速度流经层析柱。待流完后，用少量己烷淋洗漏斗。当淋洗液从层析柱中全部流出后，3,4-苯并芘已经被吸附在柱层上，然后用250mL烧瓶做接收器，用30mL苯以2～3 mL/min的速度流经漏斗和上端管壁，然后再用80 mL苯以相同速度进行洗脱，直到没有溶液流出时，再用少量苯洗涤接收瓶，洗脱液和洗涤液全部并入K-D浓缩器中。然后在约70℃水浴中减压浓缩至0.2mL左右时，用环己烷定容至0.5mL，摇匀后即可用作薄层层析的样品液。

4．样品的分离

经过柱层析净化的提取液可直接用薄层层析进行半定量分析，也用于荧光光度法测定。具体分离方法如下：

(1)制板与活化称取14g硅胶G与约38～40mL 2％咖啡因水溶液(50～60℃)，在研钵中研成糊状，用涂布器涂成10cm×20cm、厚度为0.25 mm的薄层硅胶板4块。在室温下晾15 min，再在80～85℃烘箱内活化1h，取出后置于干燥器内保存备用。如果制好的薄板放置超过一周，则需重新活化。

(2)点样与展开将10cm×20cm的薄板以横向按3cm和7cm的宽度分成左右两个区域。以距底边3cm的高度为基线，在左边区域内用10 uL 3,4-苯并芘标准溶液点成圆点，供展开后定位用。在右边区域内，将经柱净化过的样品浓缩液0.5 mL，用毛细管点成宽不超过5mm，长不超过40mm的细条。并用环己烷洗涤K-D浓缩瓶数次，洗涤液也全部点在细条上。点样时，应边点样品边吹风。然后将点好的薄板置于层析缸中，用异辛烷-氯仿溶液(1:2)作为展开剂。单向避光展开2～3次，展开约18cm时取出。

(3)收集3,4-苯并芘在暗室内紫外光灯下观察，用大头针划出与标准3,4-苯并芘R_f值具有相同部位的蓝紫色荧光带，此荧光带即为分离出的3,4-苯并芘。然后将此蓝紫色的荧光带连同硅胶在操作箱内用手术刀小心刮下，并仔细收集到10mL具塞刻度离心管中，随即用5 mL 60℃的乙醇溶解。将乙醇溶液以3000r/min离心后，上清液即可作为荧光分光光度法的测定样液。

5．样品的测定

(1)定性分析将上述样品制备中薄层分离制得的样品待测溶液与3,4-苯并芘标准溶液进行激发光谱与发射光谱特征谱图的比较，从而确定样品中是否含有苯并芘。即将盛有样液的石英皿置于荧光分光光度计中，选择适当的负高压和狭缝，将激发波长固定在383nm处，对样液和标准液在发射波长380～500nm之间分别进行扫描。当测得的样品液与标准溶液的发射光谱相互吻合或相接近时，再将发射波长固定在405 nm处，对样液和标准溶液在激发波长200～400 nm之间分别进行扫描。如果测得两者的激发光谱也相吻合时，便可认为样品中含有3,4-苯并芘。

(2)3,4-苯并芘标准曲线的绘制准确吸取每毫升含有0.1ug的3,4-苯并花标准溶液20、40、60、80和100 uL，分别注入10 mL刻度试管中，然后添加乙醇至5mL。将此3,4-苯并芘标准系列溶液在激发波长383nm、激发光狭缝为5mm和发射波长405 nm、发射光狭缝为3mm的条件下，从低浓度开始，依次在发射波长400、405、410nm处进行发射扫描，并按基线法用下式求出相对荧光强度I值。

I＝I_405nm-(I_400nm＋I_410nm)×1/2          (4-17)

根据上述测定结果，以相对荧光强度I为纵坐标，以其相应的标准3,4-苯并芘的浓度为横坐标绘制标准曲线。

(3)样品测定将装样液的石英比色皿置于比色槽中，按上述标准曲线法测定样液的相对荧光强度，由标准曲线上查出对应的标准苯并芘的量(ng/mL)，从而计算出样品中3,4-苯并芘的含量。

(4)计算

式中m'—从标准曲线上查出3,4-苯并芘的含量，ng;

V—样品浓缩后的体积，mL;

m—样品质量，g；

V₁—样品点样时吸取溶液的体积，mL。

(四)注意事项

(1)每批样品测定时，应做试剂空白，并对所测样品的相对荧光强度值加以校正。

(2)本法最低检出量为0.005 ug。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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