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亚硝胺类化合物包括亚硝胺与亚硝酰胺两类,是亚硝酸盐与胺类合成的一类化学物质,分子中均含有N-亚硝基基团。自然界存在的亚硝胺类化合物不多,但其前体物质亚硝酸盐和胺类化合物却普遍存在。当亚硝酸盐与胺类相遇时,在一定条件下,可在腌腊制品、发酵食品和人体内合成一定量的亚硝基化合物,直接或间接地导致人体多种组织器官功能障碍或器质性病变。亚硝胺类化合物还具有强烈的致癌性,是目前世界公认的几大致癌物之一。
亚硝胺类的检测方法有比色法、气相色谱-热能分析仪法(适合啤酒中挥发性N-亚硝胺类的测定)、薄层层析法和气-质谱联用法(适合酒类、肉及肉制品、蔬菜、豆制品、茶叶等食品中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二丙胺及N-亚硝基吡咯烷含量的测定方法),这也是目前现行的国家推荐检测标准。本试验介绍不需要大型仪器的经典的薄层层析法。了解用薄层层析法测定N-亚硝胺类化合物的方法,并掌握薄层板的制备技术以及常用的吸附剂与展开剂的选用和配合规则。
(一)实验原理
经提取纯化所得的N-亚硝胺类化合物,在薄层板上展开后,利用其光解生成亚硝酸和仲胺的特性,分别用二氯化钯二苯胺试剂、Griess试剂(对亚硝酸)和茚三酮试剂(对仲胺)进行显色。为避免假阳性,应对以上三种试剂的显色进行综合判定。
(二)试剂及仪器
1.试剂
(1)无水碳酸钾、无水硫酸钠、氯化钠、正己烷、二氯甲烷、无水乙醚、乙醇、吡啶、冰醋酸。
(2)无水、无过氧化物的乙醚 乙醚中往往含有过氧化物而影响亚硝胺的测定,因此,必须除去乙醚中的过氧化物。将500mL乙醚置于分液漏斗中,加入10mL硫酸亚铁溶液(每110mL水中加6mL浓硫酸和6g硫酸亚铁),不断摇动,20min后弃去硫酸亚铁溶液再加入10 mL硫酸亚铁溶液重复处理一次,然后再用水洗两次。取出处理过的乙醚5mL置于试管中,加入经稀盐酸酸化的碘化钾溶液2mL,振摇,于30min后碘化钾溶液不变黄,则乙醚处理为合格。
(3)阳离子交换树脂强酸性,交联聚苯乙烯;硅胶G(层析用)。
(4)磷酸缓冲液混合5 mL磷酸二氢钾(1mol/L)和20 mL磷酸氢二钠(0.5mol/L) ,用水稀释至250mL, pH为7~7.5。
(5)显色剂配制
①二氯化钯二苯胺试剂:1.5%二苯胺乙醇溶液和0.1%二氯化钯的0.2%氯化钠溶液,分别保存于4℃下,使用前以4:1混合。
②格林(Griess)试剂:1%对氨基苯磺酸的30%乙酸溶液和0.1% a-萘胺的30%乙酸溶液分别保存于4℃下,使用前以1:1混合。
③茚三酮试剂:0.3%茚三酮和2%吡啶的乙醇溶液。
④30%乙酸溶液:用冰醋酸加一定体积的水稀释而成。
(6)亚硝胺标准溶液配制如常法制备的二甲基亚硝胺、二乙基亚硝胺、甲基苯基亚硝胺、甲基苄基亚硝胺,再重蒸馏或减压蒸馏1~2次以制得纯品。精确称取各类亚硝胺纯品,用无水、无过氧化物的乙醚作溶剂,配制成10ug/uL的乙醚溶液,再稀释成1ug/uL和0.1ug/uL的乙醚溶液,用黑纸或黑布包裹后置于冰箱中保存。
2.仪器与设备
具塞三角瓶;分液漏斗;微量注射器;紫外灯:40W,波长253 nm;索氏抽提器:250、500mL;高速组织捣碎机;电热恒温水浴锅或大型恒温水浴槽;薄层层析用仪器;滤纸:经索氏抽提器用无水无过氧化物乙醚提取4h,以除去干扰物质,吹干备用。
(三)测定步骤
1. 样品提取
(1)粉末类粮食(面粉、玉米粉、糠等,土壤也可参照此法提取)取样100g,用处理过的滤纸包好后放入500mL索氏抽提器内,加入已除去过氧化物的乙醚500mL,在40~45℃恒温水浴上回流提取10h,将乙醚提取液移入圆底烧瓶中,并加入水100mL(先在热水浴上蒸馏出大部分乙醚,然后与发生水蒸气的玻璃烧瓶连接),进行水蒸气蒸馏,收集蒸馏液大约200mL。加入20g碳酸钾,搅拌,溶解,并转入分液漏斗内。分出乙醚层,置于1L带塞三角瓶内水层用除去过氧化物的乙醚提取三次,每次用60mL,每次强烈振摇8~10min,收集乙醚于上述1L带塞三角瓶内,并加入20g无水硫酸钠。不断振摇30~45min后,用处理过的滤纸过滤。用无水乙醚20 mL洗涤滤纸上的硫酸钠,合并乙醚液,于40~45℃恒温水浴上浓缩至体积为0.5 mL。上述操作要尽量避光,浓缩液放入小试管中置于冰箱内备用。
(2)蔬菜类食品(腌菜、泡菜、菠菜等)取样100g,切碎,于组织捣碎机中加入二氯甲烷200~300mL和碳酸钾5g,捣碎5 min,过滤于长颈圆底烧瓶中,再以二氯甲烷50mL洗涤残渣,洗液合并于滤液中,再加入25 mL磷酸缓冲液和100~150mL水,在60℃水浴中除去二氯甲烷后再加热10~15 min(二氯甲烷可回收)。然后用水蒸气蒸馏,收集溜出液200mL,蒸馏瓶需用黑布包好。在馏出液中加入20g碳酸钾,在500mL分液漏斗中,以每次100mL二氯甲烷,分三次提取,然后用无水硫酸钠吸去二氯甲烷中的水,过滤,并用二氯甲烷洗涤硫酸钠,洗液合并于滤液中,浓缩至20mL,取一定量置于具塞试管再浓缩至0.5 mL备用。上述操作要尽量避光,浓缩后的试管用黑布或黑纸遮盖,置于冰箱内。
(3)腌制肉类、鱼类、干酪等取样100g,切成小块,移入组织捣碎机中,加二氯甲烷400mL和碳酸钾5g,捣碎5 min,过滤于长颈圆底烧瓶中,再以二氯甲烷50mL洗涤残渣,洗液合并于滤液中。加入磷酸缓冲液25 mL和水约200 mL于滤液中,在60℃水浴中除去二氯甲烷后再加热10~15 min(二氯甲烷可回收)。然后用水蒸气蒸馏,收集馏出液200mL,蒸馏瓶需用黑布包好。馏出液中加入5%醋酸钠溶液(缓冲液)1mL,使pH为4.5,然后通过阳离子交换树脂(2.5cm×2.5cm),用水约10mL洗柱,合并流出物,加碳酸钾20g碱化,以下用二氯甲烷提取,操作与上述(2)相同。
2.薄层层析
(1)制板活化 取硅胶G加倍量或稍多的一些水,调制至黏度适宜后涂板,于105℃活化1.5h。
(2)点样用微量注射器将亚硝胺标准溶液0.5ug和1.0ug点于薄板两侧,再用微量注射器或毛细玻璃管将样品溶液0.1mL点于薄板中间一点上,共点三块板。
(3)展开第一次用正己烷展开至10cm,取出吹干。第二次用正己烷-乙醚-二氯甲烷溶液(4:3:2)展开至10mL,取出吹干。层析缸用黑布或黑纸遮盖。
(4)显色和判断
①薄层板喷二氯化钯二苯胺试剂,在湿润状态下放在没有滤光片的紫外灯下照射3~5 min,亚硝胺化合物呈蓝或蓝紫色斑点。
②薄层板在没有滤光片的紫外灯下照射5~10min后,喷Griess试剂,亚硝胺化合物呈玫瑰红斑点。
③薄层板先小心地均匀喷以30%乙酸,然后在没有滤光片的紫外灯下照射5~10min,用热吹风机吹5~10min,使乙酸挥发掉,再喷茚三酮试剂,并将板放在80℃烤箱内烤10~15min,亚硝胺化合物呈橘红色斑点。如果三种试剂均为阳性,则可以认为食物中存在亚硝胺;若样品中出现与标准品Rf值相同的斑点,可以初步认为样品中存在的亚硝胺与已知亚硝胺相同。样品中亚硝胺的量需要做样品的限量实验,并与标准亚硝胺的灵敏度实验相比较,以计算出样品中亚硝胺的大概含量。
(四)注意事项
1.几种亚硝胺在不同溶剂中的Rf值如表4-10所示。
表4-10 几种亚硝胺在不同溶剂中的Rf值
2.不同溶剂系统分离亚硝胺的种类如表4-11所示。
表4-11 不同溶剂系统分离亚硝胺的种类
相关链接:多氯联苯类化合物
文章来源:《食品质量与安全检测技术》
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