(一)ELISA的基本原理

ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活力。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，所以可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化速率很高，所以可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

(二)ELISA的类型

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：①固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”( immunosorbent) ;②酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”( conjugate ) ;③酶反应的底物。

根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于检验的ELISA主要有以下几种类型：

1．双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如图5-1所示：

图5-1 双抗夹心ELISA法原理图

(1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质。

(2)加受检标本，保温反应标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

(3)加酶标抗体，保温反应固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

(4)加底物显色固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测得标本中抗原的量。在检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

2．双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

3．间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，所以称为间接法，如图5-2所示。操作步骤如下：

图5-2 间接ELISA法测抗体原理图

(1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质。

(2)加稀释的受检血清，保温反应血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成分在洗涤过程中被洗去。

(3)加酶标抗体可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

(4)加底物显色间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。间接法中一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如，牛血清蛋白)再包被一次，以封闭( blocking)固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释(1:40～1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。。

4．竞争法测抗体

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体越少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后与固相抗原竞争结合。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应，如图5-3所示。

图5-3 竞争ELISA法测抗体原理图

5．竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，最后的显色也越浅。

小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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