聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。PCR技术在发展和实际应用中衍生出许多改良技术，如RT-PCR(Reverse Transcription-PCR), PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment length Polymorphism)，多重PCR(Multiple primer-PCR)，不对称PCR(Asymmetric PCR)，P皇家CR-SSCP(Single Strand Conforma-tional Polymorphism)，PCR-ASO(Allela Specific Oligonucleitides)，RAPDP-CR(RandomAmplified Polymorphic DNA)，错配PCR (Mismatched PCR)，原位PCR (in Situ PCR)，实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR )，DDRT-PCR(Differential Display RT-PCR)，免疫PCR等。

(一)PCR原理

PCR是依据DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5'-3'方向掺入单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20～40个PCR循环组成，每个循环由高温变性一低温复性(退火)一适温延伸三个步骤组成：高温时DNA变性，氢键打开，双键变成单键，作为DNA扩增的模板；低温时寡核苷酸引物与单链DNA模板特异性的互补结合即复性；然后在适宜的温度下DNA聚合酶以单链DNA为模板沿5'-3’方向掺入单核苷酸，使引物延伸合成模板的互补链，经过多个变性一退火一延伸的PCR循环，就使得DNA片段得到有效的扩增，通常情况下单一拷贝的基因经过25～30个循环可扩增100万～200万个拷贝。

最初的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段进行，但Klenow片段在高温下迅速失活，因此每一份反应都需要加一份新酶，这不仅麻烦，而且还往往导致产量低，出现产物长短不一等现象。以后人们采用从嗜热细菌分离的耐热TagDNA聚合酶才解决了这一问题，现在天然的TagDNA聚合酶或经基因工程重组生产的TagDNA聚合酶在高温下都很稳定，故在整个过程中不需要添加新的TagDNA聚合酶，从而使PCR技术迅速发展起来。

(二)PCR反应体系

PCR反应体系主要由引物、dNTP, DNA聚合酶(TagDNA聚合酶)、缓冲液、Mg²⁺和核酸模板组成。

1.引物

引物是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸，是决定PCR扩增特异性的因素，引物设计和合成的好坏直接决定PCR扩增的成败。

通常情况下设计PCR引物应遵循以下原则：

(1)通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度至少为16个核苷酸，以20～24个核苷酸为宜，这种长度的引物在聚合温度下(通常为72℃)不能形成十分稳定的杂交体。由于在低温下(37～55℃)TagDNA聚合酶也能作用，所以当寡核苷酸引物退火结合到模板上后，TagDNA聚合酶就马上开始工作(但TagDNA聚合酶在低温下工作非常缓慢)；当反应的温度升至72℃时，延伸后的产物已经足够长，所以能稳定地结合在模板上。引物的Tm值可按式(5-7)进行计算：

Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2(℃)       (5-7)

式中G+C和A+T—碱基数。

(2)引物中的碱基应当随机分布，避免在引物中出现一些单一的碱基重复序列，引物内不能形成发夹结构或产生具有二级结构的区域，引物间不能互补，引物中G+C含量约为45％～55％。

(3)在引物5'末端可加入限制酶切位点序列以便进行克隆。在酶切位点5'末端还应加上适当数量的保护碱基，以保证扩增反应产物克隆后能够被酶切。如果要使PCR产物能够直接被限制酶切割，则在设计引物的两端应稍多加几个保护碱基，否则不易切断，如表5-5所示，比较了各种限制内切酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。寡核苷酸5'末端应含有少量不配对碱基，通常并不影响其作为引物的能力。

表5-5  PCR产物末端限制性酶切位点的切断情况

注：-为不能切断；± 为不能完全切断；＋为能完全切断。

(4)引物3'末端对TagDNA聚合酶的延伸效率影响很大。实验表明在扩增HIV(人免疫缺陷病毒)时不同的引物3'末端最末一个碱基的错配对扩增效率影响不同，一般引物3'末端最好选T，不要选A, G和C。设计简并引物时3'末端的简并性应尽量小。

表5-6  引物3'末端最末一个碱基错配时的扩增效率

在设计中还应注意上下游两种引物的3'端之间应避免出现互补序列，否则扩增产物中会出现大量的引物二聚体。如无法避免这种互补序列，应通过预备实验适当调节Mg²⁺浓度以获得较多的目的产物。

(5)引物间的T_m值应尽可能接近，GC含量不能太高。

按上述这些原则设计的引物通常能够获得较好的结果。

在使用引物进行扩增反应时要注意所使用的引物浓度，一般引物浓度为1.0 umol/L,这种浓度通常足以进行30轮以上的扩增反应，更高的引物浓度会在异位引导合成，从而扩增那些不需要的序列；相反若引物浓度不足，则PCR反应的效率极低。根据不同反应的需要，上下游两种引物的浓度可以相等，也可以不等。

2.dNTP

dNTP是PCR反应所必需的底物，为四种核苷酸的混合物当四种核苷酸的浓度相同时可将核苷酸的错误掺人率降至最低。最适宜的dNTP终浓度应根据被扩增片段的长度和碱基组成来确定。一般使用的浓度为0.2mol/L。

3.DNA聚合酶

目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA聚合酶，它是由水生栖热菌(Ther-mas aquaticus)产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时间内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃, 70℃催化核酸链延长的速度是2800核苷酸/min，在100 uL反应体系中一般用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TagDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是山极端嗜热的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)产生的DNA聚合酶，是迄今发现的掺人错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延伸速度比TagDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，由于PC R反应以DNA模板进行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，直接由其将RICA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。

现在市售的TagDNA聚合酶的活力因生产厂家不同而有所不同，应根据厂家推荐的用量添加。一般100 uL反应液中加1单位的TagDNA聚合酶即足以进行30轮扩增反应。所用的酶量可根据所扩增的DNA、引物和其他因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使非特异性产物增加；而酶量过少会使目的产物的产量减少。

TagDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率约为2.5×10⁴核苷酸/每轮循环，因此以PCR获得的克隆进行测序时应注意分析由几次不同PCR克降所得到的序列，以免出错。

TagDNA聚合酶往往会在DNA链3'末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶(如T4DNA聚合酶)处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。

4．反应缓冲液

PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L ( pH 8.3～8.8)的Tris-HCl,50mmol/L KCl和1.5 mmol/L MgCl₂。反应缓冲液的pH至关重要，如果KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg²⁺至关重要，它是TagDNA聚合酶活力所必需的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。由于EDTA或磷酸根能影响Mg²⁺的浓度，所以应注意模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度(dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg²⁺浓度)。要获得最佳反应结果，必须选择合适的Mg²⁺浓度，一般为2～5 mmol/L。

5．核酸模板

以细菌为例作为模板的DNA可以是染色体DNA，也可以是质粒DNA;既可以是单链DNA分子，也可以是双链DNA分子；既可以为线性DNA分子，也可以为环形DNA分子。当以染色体DNA作为模板进行PCR扩增时所需的TagDNA聚合酶量较高。通常PCR反应体系中所需的模板的量是10'～10'拷贝的靶序列。DNA模板量过多会降低扩增的效率，增加非特异性产物。在所加的模板DNA中目的序列所占的比例越高，非特异性产物的量就越少。

DNA制品中的杂质也会影响PCR反应的扩增效率。这些杂质包括尿素、SDS、甲酰胺、乙酸钠、从琼脂糖凝胶中带来的杂质等。用酚：氯仿抽提，然后在2.5mol/L乙酸铵存在下用乙醇沉淀或用聚丙烯酰胺凝胶代替琼脂糖凝胶可减少上述杂质所造成的影响。

6．其他成分

原先在使用Klenow片段进行的PCR反应中，需要加DMSO防止聚合酶提前从合成链上脱落。现在在某些使用TagDNA聚合酶进行的反应中也可加3％～10％的DMSO，因为它可减少核酸的二级结构，对扩增GC含量较高的DNA有帮助，但高浓度DMSO会抑制TagDNA聚合酶的活力，当其浓度超过10％时会使TagDNA聚合酶的活性减少50%，因此现在进行PCR扩增时一般不加DMSO。反应中还可加明胶(0.1mg/mL), BSA(0.1mg/mL)或非离子去污剂(0.5%，如吐温20或NP-40)，它们可稳定TagDNA聚合酶，但许多反应不加这类物质也可获得良好的结果。

一般反应中还应加矿物油以防止反应在扩增过程中加热蒸发而产生的问题。有一种PCR扩增仪可使反应管盖上方的温度维持在105℃，因此可防止管中的液体向上蒸发，所以反应过程中不必添加矿物油。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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