沙门菌是一类常见的革兰阴性杆菌，目前至少发现67种O抗原和2000个以上的血清型，其中部分能引起人类疾病。所致疾病分为三种类型：肠热型、肠炎型和败血症。沙门菌通过肠道感染，是食品卫生部门重点检验的菌种，每一个带菌者都是潜在的传染源，应及早发现患者，进行隔离治疗，对饮食加工和服务人员应做定期健康检查。

检验沙门菌最常见的方法就是培养法，耗时比较长，一般需要4～7d。快速检验法有运动性增菌法、免疫扩散等方法，但特异性均不高，且需要增菌。一般作为辅助性实验诊断法。PCR法是敏感、特异、快速的新方法，为实验室检测沙门菌提供了新的思路。

(一)实验材料

乳及乳制品。

(二)方法提要

乳及乳制品经增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000×g离心5 min,尽量弃去上清液；提取DNA，取DNA模板进行荧光PCR扩增，观察荧光PCR仪的实时曲线，对乳及乳制品中的沙门菌进行快速检验。

(三)试剂和材料

试剂为分析纯或生化试剂实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
1．检测用引物(对)序列

5'-GCGTTCTGAACCTTTGGTAATAA-3'

5'-CGTTCGGGCAATTCATTA-3'

引物(对)10 umol/L。

2．探针

5'-FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT-TAMRA-3'

10 umol/L。

3．其他试剂

TagDNA聚合酶；dNTP：100 mmol/L。

核酸裂解液：2% CTAB, 100mmo/L Tris-盐酸(pH 8.0), 1.4mol/L氯化钠，20mmo/L EDTA(pH 8.0)。

10×PCR缓冲液：100mmol/L Tris-盐酸(pH 8.3) , 0.5mol/L氯化钾，15 mmol/L氯化镁。

(四)仪器和设备

实时荧光PCR仪；离心机：最大离心力≥16000×g；微量移液器：10、100、200、1000uL；恒温培养箱：(36±1)℃；恒温水浴箱：(80±0.5)℃；冰箱：2～8℃，-20℃；高压灭菌器；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；pH计；天平：感量0.01g。

(五)检测步骤

1．取样和增菌

取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品25g加入装有225 mL预热到45℃的灭菌水的三角瓶中，使样品充分混匀，(36±1)℃培养18～22h。分别移取培养18～22h的悬液各10 mL加入90 mL缓冲蛋白胨水中，(36±1)℃培养18～22h。

2．模板DNA准备

每瓶培养的缓冲蛋白陈水分别取1mL加到1.5mL离心管中。13000～136000×g离心2min，弃去上清液。加入600 uL核酸裂解液，重新悬浮起来。100℃水浴5 min后，冷却至室温。13000～16000×g离心3min，将上清液移至干净的1.5mL离心管中。加入0.8倍体积的异丙醇，放入冰箱静置1h或过夜。13000～16000×g离心2min，弃去上清液，吸干。70％乙醇轻柔倒置几次洗涤，13000～16000×g离心2min，小心弃去上清液。吸干，风干10～15min。100uL双蒸水4℃保存(如不能及时检验，置于-20℃保存)。

也可使用经过评估的等效的细菌核酸提取试剂盒。

3. DNA浓度和纯度的测定

取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照下式计算：

P＝A₂₆₀×N×50       (5-10)

式中ρ—DNA浓度，ug/mL ;

A₂₆₀—260 nm处的吸光值；

N—核酸稀释倍数

当浓度为10～100ug/mL, A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。

4．实时荧光PCR检测

反应体系总体积为25 uL，其中含：10×PCR缓冲液2.5 uL，引物对(10umol/L)各1uL, dNTP(10 umol/L) 1 uL, Taq DNA 聚合酶(5U/uL) 0.5uL，探针1 uL，水16 uL, 模板DNA 2 uL(浓度约10～100ug/mL)。反应步骤：94℃预变性1 min, 94℃变性5s，60℃退火延伸20s, 30个循环。

检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以沙门菌纯培养物提取的DNA为阳性对照，以大肠杆菌或其他非沙门菌属肠杆菌纯培养物提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。

样品设3个重复，对照设2个重复，以Ct平均值作为最终结果。

5．结果判断

(1) PCR体系有效性判定

①空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct>25.0。

②阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct>25.0。

③阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct<25.0。

以上三条有一条不满足，实验视为无效。

(2)检测结果判定在 PCR体系有效的情况下，被检样品进行检测时：

如有荧光对数增长，且Ct≤25，则判定为被检样品筛选阳性。

如无荧光对数增长，且Ct≤30，则判定为被检样品筛选阴性。

如25<Ct <30，则重复一次。如再次扩增后Ct仍为＜30，则判定沙门菌筛选阳性；如再次扩增后无荧光对数增长，且Ct=30，则判定沙门菌筛选阴性。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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