(六)操作步骤

1．增菌培养

(1)沙门菌增菌以无菌操作，称取剪碎后的瘦肉样品25g，置于灭菌均质杯内，加入25 mL缓冲陈水增菌液，以8000～10000r/ruin均质1 min，移入盛有200mL缓冲陈水增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液，调pH至6.8±0.2，于37℃水浴培养4h(以增菌液达到37℃时算起)，进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mL四硫磺酸盐煌绿增菌液的250mL玻璃瓶内，摇匀，于(42±1)℃培养(20±2)h，进行选择性增菌。

(2)单核细胞增生李斯特氏菌增菌无菌取样品25g放入灭菌均质杯加225 mL改良缓冲蛋白胨水中，充分均质。改良缓冲蛋白胨水225 mL放(30±1)℃培养(25±1)h，吸取1mL，加入10mL增菌培养液(EB)中放(30±1)℃二次增菌(25±1)h。

(3)金黄色葡萄球菌增菌无菌取样品25g放入灭菌均质杯，以8000r/min均质1 min,加200mL 10%氯化钠胰蛋白陈大豆肉汤，(36±1)℃培养48h。

(4)空肠弯曲杆菌增菌无菌取样品25g放入灭菌均质杯，加100mL弯曲杆菌增菌肉汤，轻柔振荡5 min后，静置5min。取出过滤衬套，滤干内容物，滤液放入培养瓶中，放(36±1)℃培养4h前增菌，再放(42±1)℃培养24～48h。

(5)大肠杆菌O157:H17增菌无菌取样品25g放入灭菌均质杯，加225 mL [m(EC)_n]增菌汤，(41±1)℃培养18～24h。

2．细菌DNA提取

按试剂盒操作说明进行：

(1)取上述5种增菌培养液各1 mL至一个10mL无菌离心管中混匀，从中取1mL至一个1.5mL无菌离心管中，2500r/min离心30s。取上清液800 uL到另一新的离心管中，12000r/min离心1 min。弃掉上清液，沉淀中加入180uL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。37℃作用1～3h。加入20uL Rnase溶液，振荡15s，室温放置5min。

注：余下的混合增菌液应放入冰箱，以备后期芯片检测阳性样品的确证实验用。

(2)向管中加入20 uL蛋白酶K溶液，混匀后加入220uL缓冲液GB，振荡 15s, 70℃放置20～30min。简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(3)加220 uL无水乙醇，充分振荡混匀15s。简短离心以去除管盖内壁的水珠。将全部液体转移到吸附柱中。

(4)向吸附柱中加入500 uL去蛋白液GD, 12000r/min离心30s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700 uL漂洗液PW, 12004r/min离心34s。倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

(6)向吸附柱加入700 uL漂洗液 PW, 12000r/min离心30s，倒掉废液。

(7)吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱放置2～3 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(8)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 uL经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min, 12000r/min离心30s。

(9)再次向吸附膜的中间部位悬空滴加50 uL经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液TE,室温放置2min, 12000r/min离心2min。回收得到的DNA产物于-20℃冰箱保存备用。

(10)DNA结果检测用0.s％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取物。细菌基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳，出现的电泳条带位置在10000bp以上，且清晰可见。

3.PCR扩增

(1)扩增 将提取的细菌基因组DNA同时用两个PCR反应体系进行扩增，电泳检测PCR扩增产物。PCR反应体系如表5-24、表5-25所示。

表5-24 PCR反应体系Ⅰ

表5-25 PCR反应体系Ⅱ

(2)PCR反应的循环参数94℃预变性5 min；进入循环，94℃/30s、56℃/30s、72℃/1 min 40s，共40个循环；最后72℃延伸7min。

(3)PCR扩增结果检测PCR反应结束后取3 uL扩增产物加入3 uL 2×PCR载样液，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。若在1000～1500bp之间出现明显的扩增条带，即可进行芯片杂交实验。

注：如果在此片段范围内无可见扩增条带，同时阳性质控也无可见扩增条带，则可能为扩增失败，建议更换另一批次的PCR扩增试剂，重新扩增。

4．芯片杂交

(1)杂交体系配制将杂交液置42℃水浴预热5 min，杂交体系的配制如表5-26所示。

表5-26杂交体系

(2)变性将杂交体系95℃变性5 min，冰浴5min。

(3)杂交将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒的两边凹槽内加入约80 uL灭菌水，将固定有探针片段的芯片放入杂交盒内，芯片标签正面朝上；揭掉芯片盖片的塑料薄膜，放在芯片的黑色围栏上，凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢注入15 uL变性后的杂交液。不要振动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖，放入42℃恒温水浴中，静置，杂交2h以上。

5．芯片洗涤

按需要量配制好芯片洗液Ⅰ和洗液Ⅱ，并在42℃预热30min。取出杂交后芯片，将芯片放在预热好的洗液I中，42℃水浴摇床振荡清洗4 min，再转入预热好的洗液Ⅱ中，42℃水浴摇床振荡清洗4min。最后用42℃预热好清水中振荡清洗一次，清洗后的芯片经1500r/min离心1 min以去除芯片表面的液体。此芯片可避光保存，在4h内扫描结果。

6．芯片扫描及结果判读

(1)芯片杂交结果扫描使用微阵列芯片扫描仪对洗净杂交后的芯片进行扫描分析。

(2)结果的判定标准

①信号值≥背景信号平均值＋4×背景信号值标准差，且信号值≥阴性对照信号平均值+4×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阳性；

②背景信号平均值+2×背景信号值标准差＜信号值＜背景信号平均值＋4×背景信号值标准差，且阴性对照信号平均值+2×阴性对照信号值标准差＜信号值＜阴性对照信号平均值＋4×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为疑似；

③信号值≤背景信号平均值＋2×背景信号值标准差，且信号值≤阴性对照信号平均值＋2×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阴性。

7．结果报告

若芯片检测结果为阴性，则结果报告为相应的微生物阴性；若检测结果为阳性或者疑似，则按传统方法确认。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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