一、概述

(一)主要来源

黄酮类化合物(flavonoids)是以2-苯基色原酮为母核的一类物质，指两个苯环(A环、B环)之间以一个三碳链(C环)联接而成的一系列化合物，其骨架可用C₆-C₃-C₆表示。其中C环部分可以是脂链，也可以与B环部分形成六元或五元的氧杂环。一般黄酮类化合物根据C环的结构分类，主要是以C环的氧化状况和B环所连接的位置不同可分为：黄酮及黄酮醇类、双黄酮类、二氢黄酮及二氢黄酮醇类、查耳酮类、黄烷醇类、花色素类、异黄酮类及其他黄酮类等。目前已知的黄酮类化合物单体已有8000多种，广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中。许多植物的叶、皮、根和果实中都含有一定量的黄酮类化合物。保健食品中常见的黄酮类化合物主要有：银杏素(ginkgetin),槲皮素(gnercetin)、儿茶素(catechin ),葛根素(puerarin )、大豆异黄酮(soy isoflavones)等。

原花青素(procyanidins)是一大类多酚化合物的总称，是一类有着特殊分子结构的生物类黄酮，由不同数目的黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇聚合而成。原花青素在葡萄、可可豆、山楂、番荔枝、野草莓、银杏、花生等植物中含量丰富。早在20世纪50年代法国科学家就发现可以从松树皮中提取大量原花青素，其原花青素含量达85%,70年代则发现葡萄籽提取物中原花青素含量可高达95%，是提取原花青素更好的资源。目前研究最多的是葡萄籽和葡萄皮中的原花青素。

(二)理化性质

黄酮类化合物多为结晶性固体，少数为无定型粉末。由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而呈现不同的颜色。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基而显酸性。其溶解度因结构及存在状态(糖苷和苷元)不同而有很大差异。一般游离苷元不溶或难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂及稀碱水溶液中。天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂中，难溶或不溶于苯、四氯化碳等有机溶剂中。有些黄酮类化合物在紫外光照射下产生不同颜色的荧光。黄酮类化合物能与多种金属离子，如铝离子、镁离子、铅离子或锆离子等发生配合生成有色的配合物。

原花青素为白色粉末，溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于乙醚、二氯甲烷、苯等，在280nm波长处有强吸收，在酸性溶液中加热可降解和氧化形成花青素(anthocyanidin),花青素亦称花色素。

(三)保健功能

黄酮类化合物含有多个酚羟基使其具有很强的还原性，许多黄酮类化合物已被证实有很强的清除活性氧自由基的能力，是天然抗氧化剂。黄酮类化合物还具有抗感染、调节免疫作用；具有降血脂和总胆固醇的作用，可明显提高载脂蛋白A等抗动脉硬化成分含量；还通过抗细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、干预细胞信号转录等表现出显著的抑制肿瘤作用。

(四)分析方法

黄酮化合物的测定主要有紫外可见分光光度法、荧光分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法、高效毛细管电泳法及示波极谱法等。

保健食品中总黄酮含量的测定，常用的是紫外或可见分光光度法，其操作简便、快速。通常有两种方法，一是将样品提取液直接在360nm波长处测定吸光度值，是目前我国“保健食品检验与评价技术规范”推荐方法。二是在样品提取液中加入显色剂(硝酸铝)后生成红色配合物，最大吸收峰向长波长移动，与芦丁标准系列比较定量。后者抗干扰能力较强，特异性好。

大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型糖苷两类共12种，大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆黄素和大豆黄苷是其中比较重要的化合物，通常采用高效液相色谱法测定其含量。

原花青素的测定一般采用分光光度法、HPLC法、HPLC-MS等。正丁醇-盐酸法对原花青素化学结构的依赖性比较大，不适宜低聚原花青素的测定。在香草醛-硫酸法中，硫酸的加入会引起反应体系放热，从而导致原花青素的氧化分解，而使测定结果偏低。香草醛-盐酸法对原花青素的测定具有特异性，特别是对于黄烷醇类物质测定效果较好，但由于葡萄籽的来源不同，因此，所用盐酸、香草醛的浓度、显色时间、温度也不同。铁盐催化分光光度法操作简便，是目前我国“保健食品检验与评价技术规范”的推荐方法。

二、保健食品中总黄酮检验

(一)分光光度法

1．原理保健食品中的总黄酮用乙醇超声波提取，聚酰胺粉吸附柱分离净化，用苯洗脱杂质后，总黄酮用甲醇洗脱，以芦丁为对照品，于360nm波长处测定吸光度值，标准曲线法比色定量。

2．分析步骤称取一定量的试样，加乙醇定容，摇匀后，超声波提取。吸取上清液加聚酚胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用苯洗脱杂质，然后用甲醇洗脱总黄酮，收集甲醇洗脱液，定容。

于360nm波长处测定芦丁标准溶液和样品溶液的吸光度值，依据标准曲线计算样品中总黄酮的含量。

3．方法说明取样前应尽可能研磨至细，才能达到较好的提取效果。净化时常用的聚酸胺吸附剂有30～60目和14～30目两种粒度，不同粒度的聚酞胺吸附效果有差异。因此，在测定时，应采用同一规格的聚酰胺粉。

(二)铝配合物分光光度法

1．原理黄酮类化合物中的3-羟基、4-羟基、5-羟基、4-羰基或邻二位酚羟基，在碱性条件下，可与A1³⁺ 生成红色配合物，于510nm波长处测定吸光度值，与芦丁标准系列比较定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：对于固体样品，称取一定量样品，加入乙醚回流提取，过滤，用乙醚洗涤滤渣。将滤渣中乙醚挥干，加入80％乙醇回流，过滤，用热水洗涤滤渣，合并滤液，冷却定容。

对于液体样品(含酒精的液体样品，先于水浴上挥去乙醇，用水补足至样品原始体积)，精密吸取一定量样品，用乙醚萃取脱脂、脱色素，样液供测定。

(2)测定：取芦丁标准使用液和样品提取液分别加30％乙醇。在标准系列和样液中加5%NaNO₂溶液，摇匀，再加入10%Al (NO₃)₃溶液，摇匀后加4%NaOH溶液摇匀，放置10～20分钟，于510nm波长处测定吸光度值，依据标准曲线，计算样品中总黄酮的含量。

3．方法说明

(1)NaNO₂浓度在2%～8％范围内吸光度相对稳定，因此，采用NaNO₂浓度为5%。

(2)随Al(NO₃)₃溶液浓度的增加吸光度值升高，当浓度在8%～12％时，吸光度值相对稳定，故选用10%Al(NO₃)₃。

(3)显色后，在室温低于25℃的环境中，吸光度值在2小时内保持稳定。

三、保健食品中大豆异黄酮检验

1．原理保健食品中的大豆异黄酮(包括大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆黄素和大豆黄苷)经制备、提取、过滤等前处理后，采用梯度洗脱，C₁₈柱分离，紫外检测器检测。根据色谱峰的保留时间定性，峰面积标准曲线法定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：准确称取适量粉碎、混匀的固体试样或混匀的液体样品，加入适量甲醇，超声提取20分钟，然后用甲醇定容，混匀，上清液经0.45um滤膜过滤后备用。

(2)测定：色谱条件为反相C₁₈柱(250mm×4.6mm, 5um)；检测波长：260nm；流动相：A液为乙腈,B液为磷酸水溶液(pH=3)；梯度洗脱：0～10分钟，12%A+88%B→18%A+82%B;10～23分钟，18%A+82%B→24%A+76%B; 23～30分钟，24%A+76%B→30%A+70%B; 30～55分钟，30%A+70%B→80%A+20%B ; 55～60分钟，80%A+20%B→12%A+88%B；柱温：30℃；流速：1ml/min。

取大豆异黄酮的混合标准使用液和试样净化液进行高效液相色谱分析，以保留时间定性，用峰面积标准曲线法定量，分别计算试样中的大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、大豆黄素和大豆黄苷的含量和大豆异黄酮的总量。
3．方法说明本方法适用于以大豆异黄酮为主要功效成分的保健食品及保健食品原料中大豆异黄酮的含量测定。

四、保健食品中原花青素检验

(一)铁盐催化分光光度法

1．原理原花青素经热酸处理，并在硫酸铁铵的催化作用下，水解生成红色的花青素(花色素)。在最大吸收波长546nm处测定吸光度值，计算试样中原花青素含量。

2．分析步骤对于固体试样，精确称取研细、混匀的试样，加入甲醇，超声波提取，甲醇定容，摇匀，离心后取上清液备用。

对于含油试样，用甲醇分数次搅拌洗涤，直至甲醇提取液无色，加甲醇定容备用。对于口服液，吸取适量样液，甲醇定容，摇匀供分析用。

用甲醇配制原花青素标准系列。将正丁醇与盐酸按95：5的体积比混合后，加入硫酸铁铵溶液，再加入标准系列溶液或样液，混匀，置沸水浴回流，准确加热40分钟后，立即置冰水中冷却，于546nm波长处测定吸光度值，用标准曲线法定量。

3．方法说明

(1)原花青素水解氧化为花色素，水解程度随温度的升高而增大，在100℃时达到最大值。该反应随加热时间的增长，花色素含量增加，当加热40分钟时，花色素含量达到最大值，所以应严格控制水解的温度和时间。

(2)硫酸铁铵起催化剂的作用，未使用铁盐与使用铁盐相比，样品的测定值降低近40%。

(3)本法最低检出量为3 ug，最低检出浓度为3ug/ml，最佳线性范围：3～150ug/ml。

(二)高效液相色谱法

1．原理在酸性条件下，将试样中原花青素单体或聚合物加热水解使C-C键断裂生成深红色的花色素离子，用高效液相色谱-紫外可见检测器进行检测，以保留时问定性，峰高或峰面积定量。

2.分析步骤

(1)样品处理：对于固体试样，加入甲醇超声波提取，用甲醇定容，取上清液备用。对于液体试样，吸取适量样液，加甲醇定容。对于含油试样，用少量二氯甲烷使试样溶解，加甲醇定容，摇匀。

(2)测定：色谱条件为C₁₈色谱柱(150mm×4.6mm)；柱温：35℃；紫外-可见检测器，检测波长525nm；流动相：水-甲醇-异丙醇-10％甲酸(73+13+6+8)；流速1 ml/min。

将正丁醇与盐酸按95：5(v/v)体积比混合后，取出一定量，加入硫酸铁铵溶液，再加入经0.45um滤膜过滤的样液，混匀，置沸水浴回流，加热40分钟后，立即置冰水中冷却，进行高效液相色谱分析。

3．方法说明在流动相中加入13％甲醇和6％异丙醇，灵敏度高于只用甲醇。另外，流动相中加入甲酸可改善色谱峰的峰形。

文章来源：《食品理化检验》

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