一、概述

激素(hormone)是同化激素和其他生长促进剂的简称，包括糖皮质激素、肾上腺皮质激素、去甲肾上腺激素、雌激素类(estrogens)，如雌二醇(estradiol)、炔雌醇(ethinylestradiol)、雄激素类(androgens)，如甲基睾酮(methyltestosterone)、苯丙酸诺龙(nandrolone phenylpropionate),孕激素类(progestogens)，如孕酮(progesterone)、炔诺酮(norethisterone)等w体(steroids)类同化激素和非甾体类同化激素，如己烯雌酚(diethylstilbestrol)、双烯雌酚(dienestrol)等50多种。

雌激素类是以18个碳原子雌烃(18-碳雌烃系)为基本结构构型的同化激素，化学结构如下A；雄激素类是以19个碳原子雄烃(19-碳雄烃系)为基本结构的同化激素。化学结构如下B。

孕激素类是以21个碳原子雄烃(21-碳孕烃系)为基本结构的同化激素。化学结构如下：

同化激素(assimilation)一般是白色结晶或白色粉末，不溶于水，易溶于乙醚、乙醇、丙酮、三氯甲烷等有机溶剂和氢氧化钠溶液及植物油。各种激素的熔点不同，在100～240℃范围内。

激素残留对人体健康的危害主要是：扰乱体内激素平衡，导致出生缺陷、生育缺陷、性早熟，男性女性化，诱发内分泌相关肿瘤、女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。中国、欧盟和日本等国将同化激素类列为所有食品动物中禁用的物质，在动物性食品中不得检出。

激素类药物残留检验方法有酶联免疫吸附法、荧光分光光度法、GC法、HPLC法、GC-MS法、LC-MS/MS法等。本章主要介绍HPLC法测定畜禽肉中己烯雌酚(GB/T 5009.108)和动物源食品中50种激素残留的LC-MS/MS法(GBIT 21981)。

二、高效液相色谱法测定畜禽肉中己烯雌酚残留

1．原理样品经匀浆后，经甲醇提取，过滤，用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据保留时间定性，标准曲线法定量。

2．分析步骤

(1)提取及净化：准确称取适量绞碎肉样，加甲醇振荡提取，离心，取上清液，重复提取2次，合并上清液。过滤，备用。

(2)工作曲线绘制：称取5份肉样，分别加入不同浓度的己烯雌酚标准液，按上述样品处理方法操作，备用。同时做空白实验。

(3)色谱条件：C₁₈色谱柱(6.2mm×150mm,5um)。检测波长为230nm。流动相：甲醇+0.043mol/L磷酸二氢钠(70+30)，用磷酸调节为pH5，流速：1ml/min。进样量：20ul。柱温：室温。

3．方法说明样品提取时，加入的甲醇可使样品中蛋白质凝聚，与蛋白质结合的兽药被提取出来。本方法最低检出量为1.26ng，最低检出浓度为0.25mg/kg。

三、液相色谱-质谱/质谱法测定动物源食品中多种激素残留

(一)原理

样品经匀质，酶解，用甲醇-水溶液提取多种残留激素化合物，用固相萃取富集、净化后，用液相色谱-质谱/质谱测定，内标法定量。

(二)分析步骤

1．样品处理

(1)制备匀质试样：①动物肌肉、肝、虾：取代表性样品，剔除筋膜，虾去除头和壳，充分捣碎均匀，均分成两份，密封，于-18℃以下存放；②鸡蛋、牛奶：取代表性样品，鸡蛋去壳，搅拌均匀；牛奶混匀，各均分成两份，密封，于0～4℃以下冷藏存放。

(2)酶解提取：称取试样准确加入内标溶液和乙酸-乙酸钠缓冲溶液，漩涡混匀，再加入β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酷酶溶液，于(37±1)℃振荡酶解12小时。取出冷却至室温，加入甲醇超声波提取，然后在0～4℃下离心。取上清液加适量水混匀后待净化。

(3)固相萃取净化：将酶解提取液以2～3ml/min的速度加样于已活化的ENVI-Garb固相萃取小柱，减压抽干。再将活化的氨基柱串联在ENVI-Garb固相萃取小柱下方。用二氯甲烷-甲醇(7+3)溶液洗脱并收集洗脱液，取下ENVI-Garb小柱，再用二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)洗氨基柱，洗脱液在微弱的氨气流下吹干，最后用1ml甲醇-水溶液(1+1)溶解残渣，供测定用。

2. 测定

(1)雄激素、孕激素、皮质醇激素测定：①液相色谱条件为C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm,1.7um)，或相当者。使用前依次用二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)、甲醇、水活化；流动相A,0.1%甲酸水溶液；B,甲醇；梯度洗脱。流速0.3ml/min；柱温40℃；进样量10ul。②质谱测定参考条件。电离源，雄激素和孕激素采用电喷雾正离子模式，皮质醇激素采用电喷雾负离子模式；毛细管电压3.5kV;源温度100℃；脱溶剂气温度450℃；脱溶剂气流量700L/h；碰撞室压力0.31Pa；

(2)雌激素测定：①液相色谱条件为C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm,1.7um),或相当者；流动相：A,水；B,乙腈；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10ul；梯度洗脱；②质谱测定条件：同皮质醇激素质谱测定参考条件。

常见雄激素、雌激素、孕激素和皮质醇激素和非甾体激素的特征离子，见表8-8，其余激素的特征离子参见国标GB/T 21981。

表8-8 常见激素的定性、定量特征离子

注：a为定量离子；(雄)为雄激素；(孕)为孕激素；(皮)为皮质激素；(雌)为雌激素；(非)为非街体激素：

(3)定性：各测定目标化合物的定性保留时间和与两对离子(特征离子/定量离子对)所对应的LC-MS/MS色谱峰相对丰度进行比较，要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致，同时被测试样中目标化合物的两对离子对应的LC-MS/MS色谱峰丰度比与标准溶液中目标化合物的色谱峰丰度比一致，最大允许偏差参见本章“第二节食品中抗生素类兽药残留检验”表8-5。

(4)定量：配制含有相应同位素内标物的标准系列进行测定，用内标法定量。

(三)方法说明

1．操作过程中应防止样品被污染或其中的残留物发生变化。

2．内标法定量比标准曲线法定量的准确度和精密度好，可以消除进样量的变化和色谱条件的微小变化引起的测量误差。应该在样品处理前加入内标物再进行前处理，可部分补偿待测组分在样品处理中的损失。也可以加入数种内标物，提高定量分析的精度。

3．本法50种激素在不同基质中的测定低限为0.4～2.0ug/kg，相对标准偏差为2.4%～20.8%。

文章来源：《食品理化检验》

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