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脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇检验

发布时间:2018-12-02 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1209

一、概述

(一)理化性质

单端孢霉素是由镰刀菌属产生的一类真菌代谢产物,又称单端抱霉烯族化合物,分子中只含有C、H、O三种元素。谷物中天然污染的单端孢霉烯族化合物分别属于A、B两型,化学结构式如下:

A、B两型单端孢霉烯族化合物结构中含有12,13-环氧环,认为是其毒性的化学基础。单端泡霉烯族化合物经过体内代谢,脱去环氧环结构,生成一类脱环氧单端孢霉烯族化合物,其毒性将大大降低。B型单端孢霉烯族化合物去环氧环结构后,其结构式如下:

结构式中R1、R2、R3、R4取代基不同,则得到不同的单端孢霉烯族化合物和脱环氧单端孢霉烯族化合物。常见的有:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol, NIV)、脱环氧雪腐镰刀菌烯醇(de-epoxy nivalenol, de-epoxy NIV)、脱环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇(de-epoxy deoxynivalenol, de-epoxy DON)等。 DON和NIV的结构都属于单端孢霉烯族化合物中的B型,它们的化学基本结构及理化性质,见表9-2。

表9-2 DON、NIV化合物的化学基本结构及理化性质

(二)主要来源

DON、NIV主要是雪腐镰刀菌污染玉米、小麦、大麦、燕麦等谷类植物而产生的代谢产物,其对谷物的污染率和污染水平居单端孢霉烯族化合物之首,且常与其他真菌毒素共存,在赤霉病麦中可检出高含量的DON。

(三)毒性与危害

DON,NIV的毒性主要表现为强细胞毒性和胚胎毒性,低剂量接触则表现为肠胃功能紊乱、免疫系统损害。猪对该类化合物最敏感,食用霉变的玉米饼、小麦等饲料能引起食欲缺乏、呕吐、全身无力等症状,故又称呕吐毒素。DON可以引起人类食管癌,IgA肾病、克山病、大骨节病等,而NIV在急性毒性、细胞毒性、皮肤毒性等其他生物作用方面均比DON强10倍。在谷物中NIV常与DON一起被检出。

(四)分析方法

食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的分析方法有免疫亲和层析净化高效液相色谱法(GBIT 23503),谷物及其制品中DON的测定方法是薄层色谱法和免疫测定法(GBIT5009.111)。其他检测方法有高效液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱法等。

二、免疫亲和层析净化-高效液相色谱法

1.甲原理样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)经聚乙二醇提取后,滤液过免疫亲和层析柱净化,用高效液相色谱紫外检测器检测,标准曲线法定量。

2.分析步骤

(1)样品处理:粮食及其制品试样粉碎、过筛,加入聚乙二醇8000,高速搅拌2分钟,依次经滤纸、玻璃纤维滤纸过滤,收集滤液备用;含气酒类样品先脱气,再加聚乙二醇,混匀,用玻璃纤维滤纸过滤,收集澄清滤液备用;酱油、醋、酱及其制品直接加入聚乙二醇,同粮食及其制品试样提取。

(2)净化:将净化柱连接在玻璃注射器下,提取液以1滴/秒速度通过净化柱,用pH7.0的磷酸盐清洗缓冲液、水依次冲洗净化柱,控制流速1~2滴/秒。流出液弃去,并抽干小柱。

(3)洗脱:用甲醇洗脱结合在亲和柱上的DON,供高效液相色谱检测。

(4)测定:色谱参考条件为C18色谱柱(150mm×4.6mm, 5um);柱温35℃;流动相为甲醇-水(20+80),流速0.8ml/min;检测波长218nm。

3.方法说明

(1) pH 7.0磷酸盐清洗缓冲液是指含0.8%NaCI、0.12%Na2HPO4、0.02% KH2PO4和0.02%KCI的水溶液,盐酸调节pH。

(2)本方法除粮食及其制品的检出限为0.5mg/kg外,其他的检出限为0.1mg/kg。

三、薄层色谱法

1.原理谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)经提取、净化、浓缩后,用硅胶G薄层板点样、展开,在一定温度下,薄层板中AICI。与DON作用,使DON在波长365nm紫外光下显蓝色荧光,与标准比较定量。

2.分析步骤

(1)样品提取:取粉碎样品,加适量水,用三氯甲烷-无水乙醇(8+2)提取,滤纸过滤,取部分滤液,置90℃水浴上通风挥干。

(2)样品净化:挥干后的残渣用石油醚分次溶解,再用少量甲醇-水(4+1)分次洗涤器皿,一并转入分液漏斗中,振摇,油脂进入石油醚层,而DON留在甲醇-水层。取甲醇-水提取液加入装有中性氧化铝和活性炭的层析柱中,过柱速度控制在2~3ml/min,待甲醇-水提取液过柱快完毕时,再用少量甲醇-水(4+1)淋洗柱,抽滤至柱内无液体流出,收集过柱后的净化液。

(3)点样液制备:将净化液置沸水浴上浓缩至干。趁热加入乙酸乙酯,加热至沸,使残渣中DON充分溶出,冷却至室温后转入浓缩瓶中,浓缩,最后用一定量三氯甲烷-乙腈(4+1)溶解残渣、定容,供薄层色谱分析。

(4)测定:①点样和展开:在硅胶G薄层板上需要点3个点:样品点和定位点,样品点在薄层板基线距左边缘1.8cm位置,定位点位于薄层板顶端1.5cm处,与样品点位置相对应。先将点好样品点和定位点的薄层板用乙醚-丙酮(95+5)或无水乙醚横展,使样品点中DON偏离原点,刚好与杂质荧光分开,然后在横展后的薄层板基线上、靠左边与样品点相距0.8cm处点第三点,即标准点,然后纵向展开,展开剂为三氯甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)或三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1);②测定:挥干溶剂后,薄层板用365nm紫外光照射,可见蓝紫色荧光干扰点,此时DON不显荧光。将此薄层板置于130℃烘箱中加热,取出,放冷后,再用365nm紫外光照射:若DON仍不显荧光,需在第二块薄层板上点3个点,分别是样品点十标准点、标准点、定位点,若滴加了标准液的样品点荧光斑点与标准点一致,且位置与定位点相对应,说明试样中DON含量为阴性或低于0.05mg/g;若DON显荧光,且杂质点也有荧光,而且杂质荧光斑点与DON荧光点分开,不干扰DON测定,说明试样中含有DON,为阳性试样;③阳性试样概略定量:在薄层板上点6个点:基线上点试样点和2个标准点,此标准点DON含量可为50ng、75ng或100ng;距板顶端1.5cm处点3个标准点,其DON含量约为50ng,位置与基线上各点对应。若试样点荧光强度与标准点(如DON含量为75ng的标准点)荧光强度一致,则该试样点中DON含量为75ng,再根据点样体积、稀释倍数、溶解残渣的三氯甲烷-乙腈混合液体积及与该体积相当的试样质量,对试样中DON含量概略定量。

3.方法说明

(1)阳性试样概略定量时,薄层板顶端3个标准点是起定位作用,与基线上2个标准点一起,从横向和纵向确定样品DON点的位置,达到定性目的。

(2) DON分离受空气湿度影响大,当DON有杂质干扰时,可选择极性不同的展开剂展开。

(3)如果需要同时测定NIV,需考虑选用不同的色谱柱净化,并用不同的展开剂分别展开DON和NIV。

文章来源:《食品理化检验》

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