基因芯片(gene chip)技术是20世纪90年代发展起来的分子生物学技术，可以同时对数以千计的样品进行处理分析，大大提高了检测效率，降低了检测成本。并能克服普通PCR法检测数量少、易污染、假阳性高等缺点。基因芯片技术的飞速发展和应用为转基因食品的高通量检测提供了有效的技术平台。目前国家标准《转基因产品检测基因芯片检测方法》(GB/T 19495.6)规定了转基因产品基因芯片检测方法。

一、基因芯片技术相关定义

1．基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)，属于生物芯片(biochip)的一种。该技术将大量特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于载体上，测试样品的核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA列阵中的点按碱基配对原理同时进行杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片，用计算机软件分析杂交信号强度而获得样品分子的数量和序列信息，从而实现转基因成分的检测。根据芯片探针来源不同，可分为寡核苷酸微阵列(oligo-microarray), cDNA微阵列(cDNA-microarry)及DNA微阵列(基因组DNA作为探针)等。

2．基片(substrate )或称为载片，是基因芯片中用于固定探针的基质，通常采用标准的载玻片或其他固体载体，经过化学修饰制备而成。

3．基因芯片探针(DNA microarray probe)又称寡核苷酸探针，是基因芯片中固定于基质表面、能与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的核酸分子。转基因食品检测时可用寡核苷酸片段做探针。

4．杂交(hybridization)是指两条互补的单链核酸形成的一条稳定的双螺旋分子过程。杂交反应可以发生于溶液中两个互补分子之间；也可以发生在溶液中的分子与另一个被固定在支持物上的分子之间。

二、基因芯片检测

1．原理探针与待测样品中的目标序列按碱基互补原理发生特异性杂交反应，从而实现对目标序列的检测。

该技术与传统核酸分子杂交技术相比有许多不同之处。

(1)核酸分子杂交技术是将样品的目标序列固定于固相支持物(载体)上，探针置于杂交液中；基因芯片技术则将探针固化于载体上，样品的目标序列置于杂交液中。

(2)核酸分子杂交技术的杂交是对探针进行标记；而基因芯片技术在大多数情况下是对样品目标序列进行标记(少数情况下对探针标记)。

(3)核酸分子杂交技术一次可检测1至几个目标序列；而基因芯片杂交一次可同时检测十几个至1万以上目标序列。

(4)核酸分子杂交信号检测灵敏度、准确度不够高，一般做定性分析；而基因芯片杂交信号的检测灵敏度、准确度高，不仅可做定性分析，还可做半定量甚至定量检测，并且信号检测和数据分析也实现了自动化、程序化。

2．分析步骤基因芯片的检测流程大致如下(图12-2)。

图12-2 基因芯片检测流程

(1)基因芯片准备：包括基片的选择、活化、探针的制备和基因芯片的制备。

1)基片材料选择：大部分选用固体片或薄膜类，具有如下特点：①能适应透射光和反射光的测量；②具有能与生物分子或修饰分子偶联进行化学反应的活性基团；③能使单位载体上结合的分子数达到最大容量；④材料具有惰性和足够的稳定性。制作基因芯片的材料有普通玻璃片、硅片、聚丙烯膜、尼龙膜等。

2)基片活化：对载体的表面进行化学预处理以达到活化作用，使探针稳定固定于介质表面。在片基表面上结合的活性基团包括：氨基、巯基、醛基、环氧化物等，与配基结合后形成具有生物特异性的亲和表面，可以固定蛋白质、核酸、多肽等生物活性分子。

3)探针制备：探针的获得即制备基因组文库，其方法有直接基因分离、化学合成和酶促核酸三种，然后通过PCR扩增等技术快速制备大量特异性目的核酸片段。

4)基因芯片制备：将探针固定化在已活化的基片/载体上，通过与样品中靶序列作用来获取生物信息。常用的基因芯片制作方法包括点接触法及喷墨法、光引导原位合成法、压电打印原位合成法及分子印章法等。

(2)样品中靶序列提取、PCR扩增及示踪标记：样品核酸(DNA和mRNA)的提取纯化和PCR扩增方法与一般分子生物实验方法基本一致。样品核酸中的靶序列的扩增和示踪标记是同步进行的，扩增过程中将合成新链所需要的4种底物(dNTP)其中的一种单核苷酸先用标记物进行示踪标记，以便于杂交信号的检测。目前使用最多的标记物是荧光染料，它具有极高的分辨力和灵敏度。

(3)杂交反应：将基因芯片和待测样品靶分子两者放置于杂交反应体系中，在一定条件下(杂交双方的浓度、离子强度、pH,温度)进行杂交反应，使探针与目标序列按碱基互补原则进行特异性结合。反应后洗涤芯片，去除未杂交的部分和非特异性结合，以降低检测的噪音。

(4)杂交信号检测：杂交反应完成后，将基因芯片用激光共聚焦芯片扫描仪进行扫描，激光的激发光源使荧光生色基团产生高强度的发射荧光，光电倍增管将光信号转换、放大成点信号后收集，通过计算机处理获得的数据，统计并分析结果。

三、基因芯片技术在转基因食品检验中的应用

基因芯片技术作为一种新技术，具有高通量、快速、灵敏、灵活等优点，可以同时平行检测大量样本，因此，在转基因食品检测中具有广阔的应用前景。按照功能，基因芯片可分为检测芯片和表达谱芯片。前者主要应用于转基因成分的筛选和鉴定；后者主要应用于转基因食品安全性评价。

(一)检测芯片应用

1．转基因成分筛选针对转基因技术中通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子等特异性片段设计探针点制成基因芯片。用此芯片能实现大量不同类型转基因食品的检测。结合其他的方法，还可以对转基因成分实现定量检测。

2．转基因食品品系或品种鉴定针对转基因品种特异的边界序列设计探针，点制成芯片后可以对转基因食品品系或品种进行鉴定，并且还可以明确转基因食品转入了何种目的基因。

3．转基因重组体构成元件分析针对基因重组体构成元件(目的基因、报告基因、标记基因、启动子、终止子等)设计探针并制成基因芯片，利用此芯片就可以检测出样品是否为转基因食品，采用了哪种特异性片段，以及目的基因是否发生了变异等。如果将已知转基因食品的基因重组体构成元件及构成元件和植物基因组连接区设计成探针，固化制成芯片，就可以对转基因食品进行筛选、鉴定及多种相关信息分析。因此，根据不同的检测目标可以设计不同的探针，制成不同类型和能实现同步检测大量的多种目标序列的基因芯片，满足转基因食品检测的多种需求。

(二)表达谱芯片应用

制作表达谱芯片时，将待测样品与对照样品的mRNA用荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。表达芯片在转基因食品领域中主要用于安全性评价，即转基因食品中外源特异性成分产生了怎样的影响。包括：营养成分、毒性、过敏物质等变化；基因突变或代谢途径改变；人体内发生突变而有害人体健康的可能性等。非期望效应是评价转基因食品安全性的主要方法，表达谱芯片可将相关的营养成分、毒性物质、过敏物质、代谢产物等设计探针并制成芯片，通过对样品和对照品进行大量基因的表达谱的对比分析，进一步分析基因结构和功能，尤其致敏、毒性基因表达的变化，从而发现两者基因表达谱的差别，两者的差别越大则可以明确非期望效应的性质和可能产生的安全性问题越大。随着新技术的发展、生产和应用成本的降低、标准化和普及化基因芯片技术的不断推出，基因芯片技术在转基因食品检测中的应用将日趋广泛。

文章来源：《食品理化检验》

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