四、化学对照品的标定

对一个拟定作为化学对照品使用的候选原料是否符合使用要求，只有采用多种不同分析手段对该物质进行严格、全面的评价，才能保证对照品的质量满足其使用要求。对候选原料的质量研究的要求，取决于该化学对照品的用途，有时可能需要多个独立的实验室进行协作标化。

(一)鉴别用对照品

对于鉴别用化学对照品(IR光谱或色谱方法)，如果该原料药的纯度满足使用要求，从按照止常生产工艺生产的产品中，选取一批优质原料即可。有时也可能需要供应商对该物质进行进一步的纯化(精制)。通常需要至少一个实验室按照相关质量标准进行全项的物理和化学检测。

(二)检查用对照品

用于指定杂质含量测定的化学对照品，尤其是用于限度检查时，需要对该物质进行更深入的质量研究。如果对照品用于薄层色谱法(TLC)，其纯度一般不得低于90%，用于液相色谱法(LC)或者气相色谱法(GC)的对照品，其纯度会要求更高，应不得低于95％。当对照品用于纯度检查时，通常只需一个实验室进行标化即可。如果该对照品是首次制备或者分离获得，必须采用核磁共振(NMR)、质谱(MS)和元素分析等适当的技术进行物理和化学方面的质量研究。

(三)含量测定用对照品

用于比色法、LC、GC或者UV法含量测定的化学对照品，质量研究就需要更加深入和全面。一般需要至少3个实验室对候选原料进行协作标化，标化方案应包括下列内容：

．水分测定(或干燥失重)；

．采用规定的分离技术对有机杂质进行检测(包括可能的残留溶剂)；

．包括采用滴定等方法对候选原料的含量进行测定，只是对候选原料纯度的一种确认性检测，不需要所有的协作实验室进行该项检测，测定结果也不用于对照品的定值计算。

标化方案还包括每个检测项目的系统适用性试验和判断标准。除另有规定外，容器内的对照品原料含量以“按原样计(as is)”的方式给出，使用前不需干燥处理。以干燥或冷冻干燥制品形式制备的含量测定用对照品，以每瓶中纯品的含量(mg)或国际单位标出对照品的量值计。

每个实验室都要采用包括药品标准中的方法在内的多种经过验证的分析技术，对原料进行标化。当对照品用于比色法或者UV法等非专属性含量测定方法时，必须对原料中所含杂质的相对活性或者相对响应因子进行考察。当对照品用于色谱法等专属性的含量测定方法时，准确测定杂质的含量特别重要。在这种情况下，应采用尽可能多的方法对该对照品进行检测，如有可能，还应采用相溶度分析法(phase solubility analysis)或差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)等方法对原料进行质量评价。对于酸性或碱性的物质，可进行酸碱滴定，也可采用化学计量反应对候选原料进行质量评价。对照品原料的水分、有机溶剂、矿物杂质(包括重金属在内的无机杂质)和有关物质的含量相加应为100%。对多数用于含量测定的化学对照品，其含量一般“按原样计(as is)”标识。

(四)仪器校正用对照品

如果化学对照品作为校正用物质用于仪器的校正，比如熔点对照品，对该物质的检测和质量评价要求与用于含量测定的化学对照品相近。应由多个实验室采用多种技术手段和方法对校正用物质进行协作标化，以确定该物质的纯度特别是校正特定用量值满足使用要求。在确定该对照品满足校正用途后，还应该有适当数量的协作实验室参加标化，采用适当的仪器确定该物质的最终量值。

五、标化对照品的化学和物理方法

标化对照品的目的是通过多项目的检测，确定候选物质满足对照品的使用要求：标化的方法可分为两类：第一类是确定对照品候选物质结构的鉴别方法，第二类是确定对照品纯度的分析方法。对照品的标示纯度就是根据各种分析方法的数据，对该物质真实量值的估计。

(一)用于确认化学对照品结构的方法

如果一个对照品的化学结构已经确定，可通过与权威物质红外图谱的比较进行结构确认。当该物质具有多晶型现象时，应注意晶型对红外图谱的影响。核磁共振图谱、质谱或者X射线衍射晶体学图谱等高度专属的技术可用于相关图谱的比较。对于换批对照品，当原料来源相同时只比较前后两批对照品的红外吸收图谱即可。对于首批制备的新对照品，应按照新化合物的结构确证程序，采用多种分析技术手段对化合物的结构进行确定。所用的技术可能包括元素分析、晶体学研究、质谱、核磁共振谱、官能团分析、红外光谱和紫外光谱，根据需要可能还有其他的补充试验，以便对该物质进行全面的质量研究。

(二)测定对照品纯度的方法

对待测物质进行纯度检查所用的分析方法与该物质的用途相关。可将这些分析方法分为三大类：①色谱法等具有一定选择性(专属性)的纯度测定方法；②相溶度分析法和差示扫描量热法等只依赖于物质固有热力学属性的方法；③其他方法。

用于确定化学对照品纯度的方法，应建立系统适用性要求并进行验证。

1．色谱方法(chromatographic method)是一种基于色谱分离技术的分析方法，对于化学对照品的杂质检测和定量特别有用。高效液相色谱法(HPLC)是应用最多的色谱方法，有时也会用到TLC和GC法。必要时，可对色谱法分离的相关组分进行分析。通常，HPLC和GC法的选择性要优于TLC法，HPLC和GC法的优势还表现在能够便捷地进行定量分析。测定化学对照品的杂质含量时，如能获得相应的杂质对照品，应采用外标法确定对照品中相关杂质的含量。如果没有杂质对照品，应选择杂质与主成分响应系数接近的波长作为紫外检测波长。当杂质与主成分的响应因子有显著差异时，必须采用校正因子进行校正，以便准确测定杂质的含量。配置了二极管阵列检测器的LC仪还可采用光谱法对主成分及杂质峰的纯度进行分析，必要时也可采用二维色谱技术进行峰纯度考察。LC-MS联用仪可对获得分离的杂质以及主成分进行结构鉴定，对于没有参考物质或者IR参考图谱的化学对照品标定特别有用。

同LC法一样，含量测定用GC方法也要测定杂质的响应值。

TLC法所用的仪器简单且价格较低；此项技术易于操作并且可方便地在微克水平进行试验。该方法可分离立体异构体或者同系物等结构相似的有关物质。进行TLC分析的待测物质中的所有组分，在展开后的薄层板中有相应的斑点，当然，一些组分可能会仍然停留在点样线上、一些组分可能会迁移到溶剂前沿的位置、有的组分会与主成分以相同的速度在薄层板上迁移并且其中某些组分还不能被检出。基于上述原因，通过采用二维色谱技术、多个溶剂系统、多个检测方法，可能会显著提高TLC法的分析能力和用途。在一定情况下，如果测定的准确度可以被接受，可采用光密度计进行定量分析。

当然，TLC法的大部分能力已经被HPLC覆盖，但TLC法在检视方面仍然有一些独到优势，有时可以起到互补作用。

毛细管电泳(capillary electrophoresis)：毛细管电泳(CE)是一项正在不断得到应用的通用方法，可作为LC法杂质检测的补充技术。

对于拟定干燥后使用的对照品，还应考察干燥后对照品的色谱纯度，干燥后稳定的对照品才可采用干燥后使用的处理方法。

2．热力学(thermodynamics)分析方法这是一类可以测定物质中总杂质绝对含量的方法。

(1)差示扫描量热法：一种用于考查物质是否具有多晶型并确定固体杂质总量的分析技术。根据对供试品熔融热的测定数据以及由于杂质导致的熔点改变，获得供试品的纯度估计值。是一种可以快速测定并具有高精密度的分析方法。采用DSC纯度分析，应符合以下的假设：

1)两组分形成低共熔相图、熔融过程中压力不变、试样与杂质形成理想溶液、溶液为稀溶液、熔融热与温度无关。

2)在熔融过程中被测样品中杂质与主成分不能形成固溶体、升温过程中不能熔融同时蒸发、分解或存在多晶型转变现象。

3)只有纯度较高的样品(>98.5%)的物质使用该技术进行纯度测定才能得到较理想的结果。

(2)相溶度分析方法：由于该方法的局限性以及繁杂的测定过程，已经很少被采用。该方法可用于对照品中杂质的检测，该方法可测定对照品中异构体的含量。当对照品在分析过程中发生降解、形成固体溶液或者主成分具有多晶型时，这些因素可能会使该方法不适用于对照品的纯度分析。

3．其他方法

(1)分光光度法：进行纯度测定时也会采用紫外分光光度法(UV spectrophotometry)。因为该方法是基于发色基团的特性，所以该方法可以检测那些吸光度值偏高的杂质，并根据吸光度(吸收系数)的变化，确定杂质的紫外吸收可忽略不计还是具有显著的紫外吸收。

红外分光光度法可用于立体异构体的鉴别和定量分析。核磁共振谱(NMR)是一种强大的光谱鉴别工具，目前已被多个机构用于药品对照品的纯度测定。

(2)滴定方法：滴定方法提供了一种有价值的手段，可确认化学对照品的结构和纯度，该方法还可对其他方法获得的纯度值进行确认。

(3)旋光度法：许多化学对照品具有光学活性，有时可通过旋光度法测定化学对照品中的光学异构体含量定，但是，该方法缺乏专属性并且灵敏度低。

(4)水分和有机挥发物的测定：准确测定化学对照品中的水分和挥发性物质的含量是必须的。如果适用于对照品候选原料，也常可通过规定条件下的干燥失重方法，获得水分和挥发性物质总量的数据。也可采用热重分析方法来测定化学对照品中的水分和有机挥发物含量。另外，也可采用卡尔一费休滴定方法对水分进行测定，采用GC方法对挥发性溶剂的含量进行测定。在测定水分和有机挥发物含量时，应考虑水分和有机挥发物在对照品原料中的均一性。

文章来源：《实用化学药品检验检测技术指南》

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