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高效液相色谱法基本理论(二)

发布时间:2018-12-21 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1257

(三)基本分离理论

色谱分析的任务之一就是将混合物中的各组分进行分离,两峰之间必须达到合适的分离度。两组分峰之间的分离度由组分在两相间的分配系数决定,即与分离过程的热力学性质有关,同时还应考虑到每个峰的宽度。峰宽由组分在色谱柱中的传质和扩散行为决定,与分离过程的动力学性质有关。基于色谱分离过程的热力学和动力学问题,分别发展出了塔板理论和速率理论。

1.塔板理论塔板理论将色谱柱比作一个精馏塔,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为,同时理论塔板数N作为衡量柱效的指标,理论塔板数N是反应物质在固定相和流动相中动力学特性的重要参数,是代表色谱柱分离效能的指标,其定义如下:

其中σ为色谱流出曲线的标准偏差,为峰高0.607处峰宽度的一半,为方便起见,通常采用半峰宽Wh/2代替σ计算柱效,Wh/2表示通过色谱峰峰高的中间点作平行于峰底的直线,该直线与峰两侧相交点之间的距离(见图14-1),其换算式为:

塔板理论假设:在柱内一小段长度H内,组分可以在两相间迅速达到平衡,H称为理论塔板高度,其定义为H=L/N,L为色谱柱柱长。考虑到样品在流过柱内空隙体积时,井不与固定相发生反应,可采用扣除死时间(tM)的调整保留时间(t'R)来计算塔板数或塔板高度,称为“有效塔板数(Neff)”或“有效塔板高度(Heff)”:

由上式可知,tM(越小,t'R越接近tR,Neff≈N。

在保留时间一定时,色谱峰越窄,Neff越大,Heff就越小,柱效越高。

塔板理论是一种半经验性理论,解释了色谱流出曲线的形状以及浓度极大值的位置,并提出计算和评价柱效的参数。但由于该理论的某些假设并不符合色谱柱内实际发生的分离过程,因此只能定性地给出理论塔板高度的概念,却不能解释理论塔板高度受哪些因素影响以及造成谱带扩展的原因,无法指出影响柱效的因素以及提高柱效的途径,因而限制了该理论的应用。

2.速率理论速率理论吸收了塔板理论中理论塔板高度的概念,并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程,从而在动力学基础上较好地解释了影响理论塔板高度的各种因素。由Giddings、Snyder等提出的液相色谱速率方程为:

式中,H为理论塔板高度;He为涡流扩散项;Hd分子扩散项;Hs为固定相传质阻力项;Hm为流动相传质阻力项;Hsm为滞留的流动相传质阻力项。

当组分随流动相向柱出口迁移时,由于受到固定相颗粒的阻碍,不断改变流动方向,使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动,形成涡流扩散现象,造成同时进入色谱柱的相同组分到达柱出口的时间并不一致,引起峰变宽,涡流扩散项He为:

He=2λdp=A                                      (式14-9)

式中,dp为固定相平均粒径;A为不均匀因子,表示了色谱柱填充的均匀程度;A为涡流扩散系数。为减少涡流扩散效应对理论塔板高度的影响,应尽可能地降低λ和dp,柱内填充细小且均匀的颗粒以提高柱效。

分子扩散现象是由于组分浓度梯度造成的,当样品以塞状(或点状)进样注入色谱柱后,沿色谱柱轴向,即流动相向前移动的方向,会逐渐产生浓度差扩散,而引起谱带展宽。分子扩散项Hd为:

式中,γ为色谱柱填料间的弯曲因子(γ≈0.6),反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况;Dm为组分分子在流动相中的扩散系数(Dm≈10-5cm2/s),B为分子扩散系数。组分在流动相中滞留时间越长,色谱峰谱带的分子扩散也越严重。但由于Dm的数值很小,在HPLC分析中,分子扩散引起的峰展宽很小,当流动相线性流速大于0.5cm/s时,Hd即可忽略。

固定相传质阻力项Hs主要发生在分配色谱中,组分分子从液体流动相转移进入固定相(或液膜)和从固定相转移重新进入液体流动相的过程会引起色谱峰峰型的明显扩展。Hs主要取决于固定液的液膜厚度及溶质分子在固定液内的扩散系数:

式中,q为结构因子(对均匀液膜或薄壳材料q=2/3,对大孔固定相q=1/2,对球形非多孔固定相q=1/30) ; Ds为溶质在固定相中的扩散系数;df为固定相液膜厚度;k为容量因子;u为液体流动相在色谱柱中的平均线速;Cs为固定相传质阻力系数。对于由固定相传质引起的峰展宽,主要从改善传质,加快溶质分子在固定相上解吸过程着手,如对于液-液分配色谱,可减小液膜厚度,对于吸附色谱、离子交换色谱,则可使用较小颗粒填料来解决。

在固定相颗粒间移动的流动相,对处于不同层流的流动相分子具有不同的流速,溶质分子在紧挨颗粒边缘的流动相层流中的移动速度要比在中心层流中移动的速度慢,从而引起峰形的扩展。

式中,w为无因次量,与柱内径、形状、填料性质有关,其值在0.01~10之间;Cm为流动相传质阻力系数。为减小Hm,色谱柱应填充均匀、紧密,以尽量减小颗粒间缝隙。

当使用无定形或球形全多孔固定相时,其颗粒内部的孔隙充满了流动相,溶质分子在滞留流动相的扩散会产生传质阻力,对于扩散到孔隙中滞留在表层的溶质分子,其仅需移动很短的距离,就能够很快地返回到颗粒流动相的主流路,而扩散到孔隙中滞留在流动相较深处的溶质分子,就会消耗更多的时间停留在孔隙中,当其返回到主流路时必然会伴随谱带的扩展。

式中,εi为内孔隙度;γ0为与固定相颗粒孔道弯曲程度有关的因子;Csm为滞留的流动相传质阻力系数。为减小Hsm项的影响,应使用小颗粒多空填料或表面多孔性填料。由于滞留区传质与固定相的结构有关,所以改进固定相就成为了提高液相色谱柱效的重要途径。

综上所述,液相色谱的速率方程也可简写为:

式中,A为涡流扩散项;B为分子扩散项;C为传质阻力项。通常情况下,分子扩散项可忽略不计,决定峰形扩散的是传质阻力项,此时速率方程可以表示为:

H=A+Cu                               (式14-15)

通过做H-u曲线进行比较表明,HPLC较气相色谱的H-u曲线具有较平坦的斜率,说明在HPLC分离中,使用较高的流动相线性流速,色谱柱效无明显损失,有利于实现快速分离。

相关链接:高效液相色谱法基本理论(一)

文章来源:《实用化学药品检验检测技术指南》

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