7 测定步骤

7.1 基质混合标准溶液的制备

7.1.1 样品称取

取5个阴性牛尿样品，每个10 mL，于50 mL离心管中，3000r/min离心(5.2)15 min。向5支10 mL试管中，分别加入不同量混合标准工作溶液(4.9)，使玉米赤霉醇和己烷雌酚的浓度为1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0 ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0 ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量混合内标标准溶液(4.11) ,使其浓度均为10ng/mL。加入3mL离心后牛尿的上清液，涡旋(5.4)30s溶解，待净化。

7.1.2 净化

用15 mL淋洗液(4.4)分两次预洗免疫亲和层析柱(4.7)，流速不大于3 mL/min。上样，自然流速。用5 mL淋洗液以不大于2 mL/min的速度淋洗，等体积重复淋洗一次，再用5 mL去离子水以不大于2 mL/min的速度淋洗。用4 mL洗脱液(4.5)洗脱，流速不大于2 mL/min，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪(5.3)上于40℃水浴中吹干，加入1 mL流动相，涡旋30 s溶解。溶液经滤膜(4.12)过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

7.2 试样溶液的制备

取经3000r/min离心15 min后待测样品3 mL于50 mL离心管中，加入内标标准工作溶液，使其含量均为2.0 ug/kg。按7.1.1和7.1.2操作。

7.3 空白基质溶液的制备

取经3000 r/min离心15 min后阴性样品3 mL于50 mL离心管中，按7.1.1和7.1.2操作。

7.4 测定

7.4.1 液相色谱条件

a)色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C₈, 3.5 um, 150 mm×4.6mm或相学煮，

b)柱温：25℃；

c)流动相：乙腈＋水(70+30);

d)流速：1.0 mL/min；

e)进样量：50uL。

7.4.2 质谱条件

a) 离子化方式：大气压化学电离；

b) 扫描方式：负离子扫描；

c) 检测方式：多反应监测(MRM) ;

d) 离子源温度：325℃;

e)雾化气压力：0.1035 MPa;

f)气帘气压力：0.0690 MPa;

g)辅助气压力：0.2415 MPa;

h)喷雾器电流：-5uA;

i)电喷雾电压：-4500V;

J)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。

表1 四种激素和两种内标物的定性离子对、定量离子对碰撞气能量和去簇电压

7.4.3 液相色谱-串联质谱测定

7.4.3.1 定性测定

每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在±2.5%之内；样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.4.3.2 定量测定

在仪器最佳工作条件下，基质混合标准溶液(7.1)分别进样，以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用内标法进行定量测定。样品溶液中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚激素的响应值应在工作曲线范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，标准物质液相色谱-串联质谱的多反应监测(MRM)色谱图。

7.5 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.6 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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