6 试样的制备与保存

取样品约500 g用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记，于-18℃冰箱中保存。

制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。

7 测定步骤

7.1 提取

准确称取2g组织样品(准确至0.01g)至50 mL离心管中，加入8 mL乙腈(4.1)，匀浆机上8000r/min均质20s,4000r/min离心5 min，上清液转移至50 mL离心管中；另取-50 mL离心管加入8 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，液体混匀器上振荡30 s,4 000 r/min离心5 min，上清液合并至50 mL离心管，离心管中的沉淀再加入6 mL乙腈，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，液体混匀器上振荡30 s,4000r/min离心5 min，上清液合并至50 mL离心管中，乙腈定容至25.0mL刻度，混匀备用。

7.2 净化

向上述装有样品提取液的50 mL离心管中加入10 mL乙腈饱和的正己烷(4.3)脱脂，涡旋振荡1 min,4 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，重复此操作一次，下层乙腈溶液待用。

将中性氧化铝净化柱(4.6)安置在固相萃取装置上，准确移取10.0 mL已脱脂的样品提取液至中性氧化铝净化柱中，控制流速在1 mL/min～2mL/min，用2 mL×2乙腈淋洗净化柱，收集全部流出液，流出液转移至吹氮管中，50℃下氮气吹至干，用1.00 mL乙腈溶解残渣，并置超声波水浴中超声振荡10 min, 0.2um滤膜(4.11)过滤，供液相色谱一串联质谱测定。

7.3 测定条件

7.3.1 液相色谱参考条件

a)色谱柱：Intersil C8-3柱，5um,150mm×4.6mm(内径)或相当者；

b)柱温：40℃；

c)进样量：25 uL;

d)流速：0.8 mL/min;

e)流动相：甲醇＋水，梯度洗脱，见表1。

表1 梯度洗脱程序

7.3.2质谱参考条件

a)离子源：电喷雾电离源(ESI) ;

b)扫描方式：负离子扫描；

c)检测方式：多反应监测(MRM)；

d)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度；

e)监测离子对和相应的参考质谱参数，见表2。

表2 伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的监测离子对和相应的参考质谱参数

7.3.3 液相色谱-串联质谱测定

7.3.3.1 定性测定

每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5％之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.3.3.2 定量测定

外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准工作溶液进样(4.10)，以峰面积为纵坐标，基质混合标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

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文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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