6 试样的制备与保存

6.1 牛奶

取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封置4℃下保存，并标明标记。

6.2 奶粉

取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。

7 测定步骤

7.1 提取

牛奶样品称取约5g(准确至0.01g)于50 mL具塞离心管中，奶粉样品称取约1g(准确至0.01g)并加入5 mL水于50 mL具塞离心管中，混匀。

在称取好样品的离心管中加入5 mL乙酸钠缓冲液和20uL β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床上，37℃振荡水解过夜。待水解液冷却至室温后，首先加入5 mL乙腈，振摇，以沉淀蛋白，然后再加入20 mL乙酸乙酯，涡旋振荡提取2 min后，3000r/min离心10 min，移取上清液通过5g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中。再用20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。

7.2 净化

7.2.1 凝胶色谱参考条件

凝胶色谱参考条件如下：

a)净化柱：22g S-X3 Bio-Beads填料，200 mm×25 mm(内径)或相当者；

b)流动相：乙酸乙酯-环己烷(4.11)，流速：5.0 mL/min;

c)定量环：5 mL;

d)净化程序：0 min～10 min弃去洗脱液，10 min～15.5 min收集洗脱液。

7.2.2 凝胶色谱净化

将提取液在45℃下蒸至近干，用乙酸乙酯-环己烷(1+1)定容至10 mL的玻璃试管中，按7.2.1的条件净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用1 mL甲醇溶液(4.10)旋涡振荡溶解，过0.45um滤膜供HPLC-MS-MS分析。

7.3 空白基质溶液的制备

将取牛奶阴性样品5g，奶粉阴性样品1g(精确到0.01g)，按7.1和7.2操作。

7.4 测定条件

7.4.1 液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a)色谱柱：C₁₈,5um,150 mm×2.1 mm(内径)或相当者；

b)色谱柱温度：30℃；

c)进样量：20uL;

d)流动相梯度及流速见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

7.4.2 质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a)离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+);

b)质谱扫描方式：多反应监测(MRM);

c)鞘气压力：104 kPa;

d)辅助气压力：138 kPa

e)正离子模式电喷雾电压(IS):4000V;

f)毛细管温度：320℃；

g)源内诱导解离电压：10V;

h)Q1为0.4, Q3为0.7 ;

i)碰撞气：高纯氢气；

J)碰撞气压力：0.2Pa;

k)其他质谱参数见表2。

表2 被测物的参考保留时间、采集窗口、监测离子对和裂解能量

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文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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