5 仪器

5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。

5.2 分析天平：感量0.1mg和0.01g。

5.3 液体混匀器。

5.4 固相萃取装置。

5.5 氮气吹干仪。

5.6 恒温振荡水浴。

5.7 真空泵：真空度应达到80 kPa。

5.8 微量注射器：25uL，100uL。

5.9 棕色具塞离心管：25 mL,50 mL。

5.10 pH计：测量精度±0.02pH单位。

5.11 贮液器：50 mL。

5.12 高速离心机：转速10000 r/min以上。

6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样。

6.2 试样保存

试样置于-18℃冰柜，避光保存。

7 测定步骤

7.1 待测样品溶液的制备

7.1.1 牛奶样品脱蛋白、水解和衍生化

称取牛奶样品8g(精确到0.01g)，置于50 mL棕色离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液(4.15)向上述离心管中加入0.2 mL衍生剂(4.16)，再加入适量混合内标溶液(4.23)，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。离心管取出后放置至室温，在10000r/min下离心10 min，上清液倒入另一棕色离心管中。

7.1.2 奶粉样品脱蛋白、水解和衍生化

称取奶粉样品1g(精确到0.01g)，置于50 mL棕色离心管中，加入8 mL水，涡旋混合后，再加入15 mL三氯乙酸溶液(4.15)。向上述离心管中加入0.2 mL衍生剂(4.16)，再加入适量混合内标溶液(4.23)，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。离心管取出后放置至室温，在10000 r/min下离心10 min，上清液倒入另一棕色离心管中。

7.1.3 样品溶液净化

上述衍生溶液加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液(4.12)，用4 mol/L氢氧化钠溶液(4.14)调节溶液pH约为7.4，在10000r/min下离心10 min，上清液倒入下接Oasis HLB固相萃取柱(4.24)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2 mL/min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱(4.24)，待样液全部通过固相萃取柱后用20mL 20％甲醇水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。抽干Oasis HLB固相萃取柱(4.24)15 min。用5 mL乙酸乙酯(4.4)洗脱，收集洗脱液于 25 mL棕色离心管中，在氮气吹干仪上45℃水浴吹干，准确加入1.0 mL样品定容溶液(4.17)溶解残渣，混匀后过0.2um滤膜(4.25),供液相色谱-串联质谱测定。

7.2 混合基质标准校准溶液的制备

7.2.1 牛奶混合基质标准校准溶液的制备

称取五个阴性牛奶样品，每个样品为8 g(精确到0.01g)。分别加入适量混合标准溶液(4.21)，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.1ug/kg、0.2ug/kg、0.5ug/kg、1.0ug/kg和2.0ug/kg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液(4. 23)，含量均为2.0ng/mL。同7.1.1和7.1.3操作，作为牛奶标准校准曲线。

7.2.2 奶粉混合基质标准校准溶液的制备

称取五个阴性奶粉样品，每个样品为1g(精确到0.01g)。分别加入适量混合标准溶液(4.21)，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.8ug/kg、1.6ug/kg、4.0ug/kg、8.0ug/kg和16.0ug/kg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液(4.23)，含量均为2.0ng/mL。同7.1.2和7.1.3操作，作为奶粉标准校准曲线。

7.3 测定条件

7.3.1 液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a)色谱柱：Atlantis C₁₈, 3.5um,150 mm×2.1 mm(内径)或相当者；

b)柱温：35℃；

c)进样量：40uL;

d)流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱参考条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱参考条件

7.3.2 质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a)离子源：电喷雾离子源(ESI)

b)扫描方式：正离子扫描：

c)检测方式：多反应监测(MRM)

d)电喷雾电压(IS) : 5000V:

e)辅助气(AUX)流速：7L/min;

f)辅助气温度(TEM) :480℃；

g)聚焦电压(FP): 150V;

h)碰撞室出口电压(CXP) :11V;

i)去簇电压(DP) :45V;

J)四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的质谱参数见表2。

表2 四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的质谱参数

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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