一、案例

食用着色剂，又称食用色素，使食品着色，从而改善食品色调和色泽。食用色素改变食品感官色彩，刺激人们的食欲，是食品生产中不可缺少的重要组成部分。人工合成的色素，色泽鲜艳，着色力强，色调多样，在食品加工过程中稳定性好且价格低廉，但作为化学合成物常具有一定毒性，我国《食品添加剂使用卫生标准》中规定了食用合成色素的使用范围及最大使用量。其中苋菜红、胭脂红、赤藓红、诱惑红、新红的最大使用量为0.05g／kg，柠檬黄、日落黄、靛蓝的最大使用量为0.1g／kg，亮蓝的最大使用量为0.025g／kg。

二、选用的国家标准

GB／T 5009．35—2003食品中合成着色剂的测定——高效液相色谱法。

三、测定方法

1．试样处理
(1)橘子汁、果味水、果子露汽水等 称取20.O～40.0g，放入100mL烧杯中，含二氧化碳的试样加热去除二氧化碳。

(2)配制酒类 称取20.0～40.0g，放入100mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热去除乙醇。

(3)硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等 称取5.00～10.00g粉碎试样，放入100ml。小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若试样溶液pH值较高，用柠檬酸溶液调pH值到6左右。

(4)巧克力豆及着色糖衣制品 称取5.00～10.00g，放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到试样无色素为止，合并色素漂洗液为试样溶液。

2．色素提取

(1)聚酰胺吸附法 试样溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将lg聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃ pH值为4的水洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合溶液洗涤3～5次(含赤藓红的试样用液一液分配法处理)，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经0.45µm滤膜过滤，取10µL进高效液相色谱仪。

(2)液一液分配法(适用于含赤藓红的试样)将制备好的试样溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺一正丁醇溶液(5％)10-20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经滤膜0.45µm过滤，取10µl进高效液相色谱仪。

3．高效液相色谱参考条件

柱：YWG-C1810µm不锈钢柱4.6mm(i.d)×250mm。

流动相：甲醇一乙酸铵溶液(pH值为4，0.02mol／L)。

梯度洗脱：甲醇20％～35％，3%／min；35％～98％，9%／min；98％继续6min。

流速：lmL／min。

紫外检测器，254nm波长。

4．测定

取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

5．结果计算

X=A*1000/m*V2/V1*1000*1000

式中 X——试样中着色剂的含量，g／kg；

A——样液中着色剂的质量，µg；

V₂——进样体积，mL；

V₁——试样稀释后总体积，mL；

m——试样质量，g。

6．试剂

①正己烷。

②盐酸。

③乙酸。

④甲醇：经0.5µm滤膜过滤。

⑤聚酰胺粉(尼龙6)：过200目筛。

⑥乙酸铵溶液(0.02mol／L)：称取1.54g乙酸铵加水至1000mL，溶解，经0.45µm滤膜过滤。

⑦氨水：量取氨水2mL，加水至100mL，混匀。

⑧氨水一乙酸铵溶液(O.02mol／L)，量取氨水0.5mL，加乙酸铵溶液(O.02mol／L)至1000mL，混匀。

⑨甲醇一甲酸(6+4)溶液。

⑩柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，加水至100mL，溶解混匀。

⑥无水乙醇一氨水一水(7+2+1)溶液：无水乙醇70mL，氨水20mL，水10mL，混匀。

⑥三正辛胺一正丁醇溶液(5％)：量取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL，混匀。

⑥饱和硫酸钠溶液。

⑩硫酸钠溶液(2g／L)。

⑥pH值为6的水：水加柠檬酸溶液调pH一6。

⑩合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置于100mL容量瓶中，加pH值为6的水至刻度，配成水溶液(1.00mg／mL)。

⑩合成着色剂标准使用液：临用时上述溶液加水稀释20倍，经0.45µm滤膜过滤，配成每毫升相当于50.0µg的合成着色剂。

7．仪器

高效液相色谱仪：带紫外检测器，254nm波长。