1．检测原理

水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。

最低检出量为50ug。点样量为1uL时，检出浓度约为50mg/kg。

2．试剂与材料

(1)石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、聚酰胺粉(尼龙6, 200目)、硅胶G、硫酸(1+10)、盐酸(1+10)、甲醇-甲酸溶液(6+4)、氢氧化钠溶液(50g/L)、乙醇(50％)、柠檬酸溶液(200g/L)、钨酸钠溶液(100g/L)。

(2)海砂：先用盐酸(1+10)煮沸15min，用水洗至中性，再用氢氧化钠溶液(50g/L)煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，储于具玻璃塞的瓶中，备用。

(3)乙醇-氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70％)至100mL。

(4)pH6的水：用柠檬酸溶液(20％)调节至pH6。

(5)碎瓷片：处理方法同(2)。

(6)合成着色剂标准溶液：准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、觅菜红、胭脂红、新红、赤鲜红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度。配成水溶液(1.00mg/mL)。

(7)着色剂标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。

(8)展开剂如下：

①正丁醇-无水乙醇-氨水(1％)(6+2+3)：供纸色谱用。

②正丁醇-吡啶-氨水(1％) (6+3+4)：供纸色谱用。

③甲乙酮-丙酮-水(7+3+3)：供纸色谱用。

④甲醇-乙二胺-氨水(10+3+2)：供薄层色谱用。

⑤甲醇-氨水-乙醇(5+1+10)：供薄层色谱用。

⑥柠檬酸钠溶液(25g/L)-氨水-乙醇(8+1+2)：供薄层色谱用。

3．仪器

(1)可见分光光度计。

(2)微量注射器或血色素吸管。

(3)展开槽，25cm×6cm×4cm。

(4)层析缸。

(5)滤纸：中速滤纸，纸色谱用。

(6)薄层板：5cm×20cm。

(7)电吹风机。

(8)水泵。

4．检测步骤

1)试样处理

(1)果味水、果子露、汽水：称取50.0g样品于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。

(2)配制酒：称取100.0g样品于100mL烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。

(3)硬糖、蜜饯类、淀粉软糖：称取5.00或10.0g粉碎的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH较高，用柠檬酸溶液(200g/L)调至pH 4左右。

(4)乳糖：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL，立即用硫酸溶液(1+10)调至微酸性，再加1.0mL硫酸(1+10)，加1mL钨酸钠溶液(100g/L)，使蛋白质沉淀、过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

(5)蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀，用热风吹干样品(用手摸已干燥即可以)，加入30mL石油醚搅拌。放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理3次，以除去脂肪，吹干后研细，全部倒入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，置水浴上浓缩至约20mL，立即用硫酸溶液(1+10)调至微酸性，再加1.0mL硫酸(1+10)，加1mL钨酸钠溶液(100g/L)，使蛋白质沉淀、过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

2)吸附分离

将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5～1.0g聚酰胺粉充分搅拌，用柠檬酸溶液(200g/L)调pH至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附着色剂的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤，可以用水泵慢慢地抽滤)。用pH4的70℃水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇-甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇(50％)洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。

3)定性

(1)纸色谱。取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3～10uL样品溶液、1～2uL着色剂标准溶液，挂于分别盛有正丁醇-无水乙醇-氨水(1％)(6+2+3)、正丁醇-吡啶-氨水(1％)(6+3+4)的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15 cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。

也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用甲乙酮-丙酮-水(7+3＋3)。

(2)薄层色谱。

①薄层板的制备。称取1.6g聚酰胺粉、0. 4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。

②点样。离板底边2 cm处将0.5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2uL色素标准溶液。

③展开。览菜红与胭脂红用甲醇-乙二胺-氨水(10+3+2)展开剂，靛蓝与亮蓝用甲醇-氨水-乙醇(5+1+10)展开剂，柠檬黄与其他着色剂用柠檬酸钠溶液(25g/L)-氨水-乙醇(8+1+2)展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出晾干，与标准斑比较，如Rf值相同即为同一色素。

4)定量

(1)试样测定。将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。

将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，作比色用。

(2)标准曲线制备。分别吸取0、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL胭脂红、芡菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。
上述样品与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm,芡菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm,靛蓝620nm) ,测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准系列目测比较。

5．结果计算

试样中着色剂的含量按下式计算：

式中：X—试样中着色剂的含量，g/kg;

A—测定用样液中色素的质量，mg;

m—试样质量或体积，g或mL;

V₁—试样解吸后总体积，mL;

V₂—样液点板(纸)体积，mL。

计算结果保留两位有效数字。

文章来源：《食品安全快速检测技术》

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