一、蛋白质的速测技术—双缩脲分光光度比色法(Biuret法)

1．速测原理

双缩脲(NH₂-CO-NH-CO-NH₂)是2个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。双缩脲在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量，测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

2．速测范围

本法适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定；在生物化学领域中测定蛋白质含量时也常用此法。

3．试剂与材料

1)试剂

(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10mg/mL的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/mL的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H₂O或0.9％ NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。

(2)双缩脲试剂：称取1.50g硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)和6.0g酒石酸钾钠(KNaC₄H₄O₆·4H₂O)，用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL 10％ NaOH溶液，用水稀释到1L，储存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若储存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2)器材

可见光分光光度计，大试管15支，旋涡混合器等。

4．速测步骤

(1)标准曲线的测定。取12支试管分两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1mL，然后加入4mL双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(20～25℃)下放置30min，于540nm处进行比色测定。未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

(2)样品的测定。取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/mL。

二、蛋白质的速测技术—双缩脲试剂盒法

1．速测原理

蛋白质具有两个以上的肽键，具有双缩脲反应现象，在碱性溶液中，能与Cu²⁺形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的含量。

2．速测范围

本方法适用于乳粉及液态乳中蛋白质含量的现场快速检测。

3．试剂盒组成

蛋白质含量速测盒(显色剂、比色管、滴管及支架)。

4．速测步骤

(1)乳粉测定。用盒内小勺取乳粉一平勺(约30mg)到比色管中，加入4mL显色剂，加盖，用力将乳粉摇溶，在15min内将检测管与标准比色卡对比，找出与色卡上相近的色阶即为每100g乳粉样品中蛋白质的含量。

(2)液态乳测定。取3滴(约0.15mL)液态乳到比色管中，加入4mL显色剂，加盖摇匀，在15min内将检测管与标准比色卡对比，找出与色卡上相近的色阶，其读数除以5即为每100mL样品中蛋白质的含量。

5．说明

(1)当样品中蛋白质含量低于产品包装标示含量时，可送实验室中进一步检测。

(2)显色液若出现黑色沉淀时，应停止使用。

(3)取样勺每次使用前应擦净。

6．试剂质量控制

定期与国标法检测进行比对，所得结果应在±20％以内。

文章来源：《食品安全快速检测技术》

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