北京普天同创生物科技有限公司
一、案例
氯霉素是一种广谱抗生素,由于其具有效果好以及价格低廉等优点被普遍应用于各类家禽、家畜、水产品等的各种传染性疾病的治疗。然而食品中氯霉素残留会抑制人体骨髓的造血功能,引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症,低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性,如果长期微量摄入含有氯霉素残留的食物,不仅能使大肠杆菌、沙门菌等菌株产生耐药性,而且能使机体正常菌群失调,从而感染各种疾病。
二、选用的国家标准
GB/T 9695.32--2009肉与肉制品氯霉素含量的测定——气相色谱-质谱法。
三、测定方法
1.提取
称取10:OOg样品于50mL具塞离心管中,加入少量无水硫酸钠和30mL乙酸乙酯,均质lmin,以5000r/min离心5min,用吸管吸出上层乙酸乙酯转移至浓缩瓶中,残渣用15ml。乙酸乙酯再提取一次,合并提取液,提取液在50℃水浴中旋转蒸发,除去乙酸乙酯,加入lmL甲醇一氯化钠溶液和4mL正己烷,充分振摇后,移至lOml。具塞离心管中,用lml,甲醇氯化钠清洗浓缩瓶,合并清洗液于lOml。具塞离心管中,涡旋0.5min,于3000r/min离心3min后,用吸管吸去正己烷,加入4mL正己烷重复上述操作。然后在离心管中加入4mL乙酸乙酯,涡旋lmin,经3000r/min离心3min后,用吸管吸去乙酸乙酯,加入4mL乙酸乙酯重复上述操作。合并乙酸乙酯于浓缩瓶中,在50℃水浴中旋转蒸发,至近干,用5mL水溶解残渣。
2.净化与衍生化
依次用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇、5mL水活化c18固相萃取柱,然后加上述提取液,加5mL甲醇+水(2+8)淋洗色谱柱,用25mL甲醇洗脱于浓缩瓶中,洗脱液在50~C水浴中浓缩至近干,用100µl。甲醇溶解残渣。转移至10mL具塞离心管中,再用甲醇冲洗浓缩瓶,合并洗液,于50C下用氮气吹干。
在吹干的试样残渣中加入100µl.甲苯和100µL混合衍生剂,盖紧塞后,涡旋混匀lmin,60℃下反应30min,于50℃下用氮气吹干,用1mL正己烷溶解残渣。
标准工作液和空白液(除不称取试样外)按照上述步骤衍生化。
3.测定
(1)气相色谱一质谱条件
①色谱柱:DB一5MS石英毛细管柱,30m×0.25mm(内径)×0.25µm,或相当者。
②色谱柱温度:初始55℃保持lmin,以25℃/min升至280℃,保持6min。
③进样口温度:250℃。
④进样量:1.0µL。
⑤进样方式:不分流进样,保持lmin。
⑥载气:氦气,纯度≥99.999%。
⑦流速:1.65mL/min。
⑧接口温度:280℃。
⑨离子源:NCI源,70eV。
⑩溶剂延迟:7min。
⑧离子源温度:150℃。
⑥反应气:甲烷,纯度≥99.99%。
⑩选择离子检测:见表13 3。
表13—3选择离子检测
保留时问/min |
目标物 |
检测离子m/z |
12.58 |
CAP—TMS |
466,468,376,378 |
(2)定性测定 进行试样测定时,如果检出色谱峰的保留时间与标准物质相一致,并且在扣除背景后的样品质谱图中,所选择的离子均出现,而且所选择的离子比与标准物质衍生物的离子比相一致(各相关离子比在相关标准品的10%之内),则可判断样品中存在氯霉素。
(3)定量测定 吸取1µL衍生的试样液、标准液或空白液注入气相色谱一质谱联用仪中,以m/z466为定量离子,标准工作液氯霉素的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。根据试样液的峰面积,从标准曲线上查出对应的氯霉素浓度值。用标准工作曲线对试样进行定量,样品溶液中氯霉素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。
在上述色谱条件下,氯霉素衍生物的参考保留时间为12.58min。
4.结果计算
X=(C-C0)*V*10-3
式中 X——试样中氯霉素的含量,µg/kg;
C——从标准工作曲线上查到的试样液中氯霉素的浓度,ng/mL;
C0——从标准工作曲线上查到的空白液中氯霉素的浓度,ng/mL;
V——试样溶液的定容体积,mL;
m——试样的质量,g。
5.试剂
①氯霉素(CAP)标准物质:纯度≥99%。
②甲醇:色谱纯。
③三氯甲烷。
④正己烷:色谱纯。
⑤乙酸乙酯。
⑥无水硫酸钠。
⑦氯化钠。
⑧N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)。
⑨三甲基氯硅烷(TMCS)。
⑩丙酮:色谱纯。
⑩甲苯。
⑩甲醇+水溶液(2+8)。
@氯化钠溶液(40g/L)。
@甲醇一氯化钠溶液:量取甲醇溶液20mL、氯化钠溶液80mL,混匀。
@混合衍生化试剂:N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99+1)。
@氯霉素标准储备液:准确称取适量氯霉素标准品(精确到0.1mg),以甲醇配制成浓度为100µg/mL的标准储备液。
⑥氯霉素标准工作溶液:根据需要,用丙酮稀释标准储备液,配成适当浓度的标准工作溶液。
6.仪器
①气相色谱质谱联用仪。
②均质器。
③固相萃取装置。
④振荡器。
⑤旋转蒸发仪。
⑥漩涡混合器。
⑦离心机。
⑧恒温箱。
⑨氮吹仪。
⑩具塞离心管。
⑥C18固相萃取柱或相当者:200mg,3mL。
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