免疫亲和萃取柱的性能评价(二)
来源/作者:中国标准物质网  日期:2019-05-15

四、使用寿命

在目标化合物的洗脱过程中,由于固定化抗体周围环境条件的剧烈变化,使抗体的空间结构发生改变,失去活性。当环境条件恢复时,一部分抗体的空间结构仍不能恢复到正常状态,从而造成抗体活性的损失。如前所述,比较缓和的洗脱条件,如用pH为3左右的甘氨酸缓冲液作为洗脱剂,有助于抗体活性的保持,而一些剧烈的洗脱条件,如加入有机溶剂或变性剂则对抗体的活性有较大的损害,从而影响免疫吸附剂的使用寿命。但是比较缓和的洗脱条件一般会伴随着洗脱液体积的增大,并且一些结合比较牢固的化合物也难以洗脱下来,这样不利于后面分析工作的进行。因此,在方法的建立过程中,应对洗脱液和使用寿命(reusability)进行综合考虑。

另外一个可能影响免疫吸附剂使用寿命的因素是固定化抗体的流失。比如,Godfrey发现,在300uL免疫吸附剂装填的免疫亲和柱反复使用60次以后,用ELISA检测其洗脱液中抗体的浓度仍可达到98ng。为减少抗体的这种流失,当抗体固定在载体之后必须对载体进行充分洗涤,洗涤液可以是含较高浓度盐(如1mol·L-1的NaC1)的缓冲液,也可以是具有半解离条件的缓冲液。

目前,文献报道的免疫亲和柱的使用寿命多在几十次以上,并且主要与洗脱条件有关。比如,Water等报道,以甘氨酸缓冲液作为洗脱液时,免疫亲和柱可以反复使用30次以上,而柱容量没有明显变化;但如果以甲醇作为洗脱剂,对同样的免疫亲和柱,使用2次以后,柱容量即下降为原来的50%。又如,A.Hoube:等用阿特拉津抗体制备的免疫亲和柱萃取三嗪类除草剂,在洗脱条件为20%甲醇水溶液(用HCl调节pH=1)时,可稳定使用20次以上。而Shi等用免疫亲和柱萃取BTEX化合物,在洗脱液为0.05mol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH=2.5)时,免疫亲和柱的使用寿命达到了9个月以上。温和的洗脱条件虽然可以延长免疫亲和柱的使用寿命,但是这种洗脱方式一般需要消耗较多的洗锐溶液和洗脱时间,不利于后续色谱检测。因此,商业化免疫亲和柱,如德国Romer.美国Vicam, Beacon等公司的免疫亲和柱都采用有机溶剂洗脱的方式。虽然这种洗脱条件具有洗脱溶剂用量少、洗脱时间短等特点,但是免疫亲和柱只能一次性使用:为降低检测成本,一些研究者探索了商业化免疫亲和柱的重复利用问题。例如,赵丽元等选用了使用最广泛的美国Vicam公司的AflaTestTMP免疫亲和柱为研究对象,对其重复利用的影响因素进行研究。结果发现样品基质、亲和柱处理时的有机溶剂,空气暴露和复性时间均可影响柱子重复利用。李佩暖等,“研究了Vicam公司黄曲霉毒素免疫亲和柱的回收纯化处理方法。使用过的免疫亲和柱分别用甲醇-水、水冲洗,再用PbS缓冲溶液进行填充,放入冰箱内于2~8℃保存。结果显示,新柱子使用后,经过两次处理,柱效基本不受影响,即免疫亲和柱可重复使用2次(一共可使用3次)。最近,Zhang等报道了利用包埋Cu(Ⅱ)的聚合物作为固相载体固定抗体的新方法,该方法提高了固定抗体的稳定性。他们利用该方法将橘青霉素高亲和力抗体固定,制备了橘青霉素免疫亲和柱。在含80%甲醇、pH=3的洗脱剂条件下,反复使用20次以后,柱容量仍叮达到初始柱容量的86%。

文章来源:《环境样品前处理技术》

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【关键词】甘酸 磷酸盐 甲醇 中国标准物质