7 测定步骤

7.1 提取与净化

称取试样约5g(精确至0.01g)于50 mL离心管中，加入30 mL乙腈提取剂(4.8)及10g无水硫酸钠(4.6)后，涡旋混合1 min，在35℃以下水浴超声提取10 min，再以3000 r/min离心5 min。将上清液移入预置有20 mL正己烷的125 mL分液漏斗中，振摇0.5 min后，静置分层；收集下层乙腈相，正己烷相留在分液漏斗，待本试样后续脱脂重复使用。

按上述步骤对离心管中的残留物每次用20 mL 乙腈提取剂再重复提取两次，所得提取液用上述正己烷相依次脱脂。合并三次脱脂后所收集的乙腈相，加入5 mL、正丙醇，于40℃以下旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至5.0mL，0.20um滤膜过滤，滤液待测。

测定操作应避强光、连续进行。

7.2 高效液相色谱法测定

7.2.1 色谱条件

a)色谱柱：Waters Symmetry C₁₈ ,4.6 mm(内径)×250 mm, 5 um，或相当者；

b)柱温：35℃；

c)流动相：乙腈-水(95+5，体积比)；

d)流速：1.0 mL/min;

e)检测波长：471 nm;

f)进样量：50uL。

7.2.2 色谱测定

根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中角黄素、虾青素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，虾青素反式、顺式异构体保留时间分别约为8.4 min、10.6 min，角黄素反式、顺式异构体的保留时间分别约为17.5min、19.0min。根据峰面积外标法定量。

7.3 确证

7.3.1 液相色谱-质谱/质谱条件

a)色谱柱：Acquity UPLC BEH C₁₈柱，2.1(内径)mm×55 mm， 1.7um，或相当者：

b)柱温：30℃;

c)进样量：10uL；

d)流速：0.3 mL/min；

e)流动相和梯度洗脱：流动相和梯度洗脱程序见表1;

f)离子源：电喷雾源ESI，正离子模式；

g)扫描方式：多反应监测(MRM)。

表1 流动相和梯度洗脱程序

7.3.2 液相色谱-质谱/质谱确证

将7.1中所得样液(必要时用液相色谱纯乙腈稀释至适当浓度)和混合标准工作液用LC-MS/MS检测。如果样液和混合标准工作液两者检出的色谱峰保留时间一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，其相对偏差不超过表2中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。

表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

7.4 空白实验

除不称取试样外，按上述测定步骤进行。

8 结果计算

采用外标法定量，按式(1)计算样品中角黄素或虾青素的含量：

式中：

X—样品中角黄素或虾青素的含量(顺、反式异构体总量)，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

A—测定液中角黄素或虾青素的峰面积；

c—标准工作液中角黄素或虾青素的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)；

V—定容体积，单位为毫升(mL);

A_s—标准工作液中角黄素或虾青素的峰面积；

m—最终样液所代表的样品质量·单位为克(g)。

9 测定低限与回收率

9.1 测定低限

本方法中高效液相色谱法对角黄素、虾青素的测定低限均为：0.1mg/kg。

9.2 回收率

高效液相色谱法测定角黄素、虾青素的回收率数据参见表3。

表3 回收率数据

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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