5.3 主要试剂

除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/ T 27025的规定。

5.3.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。去离子水电阻应达到18.2Ω。

5.3.2 琼脂糖：电泳级。

5.3.3RNase A酶溶液：冻干品，不含DNase，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为10g/L的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。

5.3.4 CTAB提取缓冲液I：在800 mL去离子水中加入46.75g氯化钠，溶解后加入1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)50 mL，0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠溶液调节溶液的pH值至8.0，用水定容至1 L，分装后高压灭菌。

5.3.5CTAB提取缓冲液且：在800 mL去离子水中加入46.75g氯化钠，20g溴代十六烷基三甲胺(CTAB)，完全溶解后加入1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 50 mL, 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL，用水定容至1L，分装后高压灭菌。

5.3.6 蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20 mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。

5.3.7TE缓冲液(pH值8.0)：在800 mL水中，依次加入10 mL、的1 mol/LTris+盐酸(pH8.0)和2mL的500 mmol/L EDTA(pH8.0)，用水定容到1L，分装后高压灭菌。

5.3.875％乙醇,70％乙醇等有机试剂。

5.3.9 动物基因组DNA提取纯化试剂盒。

5.3.10 10×PCR缓冲液：氯化钾100 mmol/L，硫酸铵160 mmol/L，硫酸镁20 mmol/L, Tris-HCI(pH 8.8)200 mmol/L，Triton X-100 1％，BSA 1 mg/mL。

5.3.11 dNTP溶液(dGTP, dCTP, dATP, dTTP或dUTP)：各2.5 mmol/L。

5.3.12 Taq DNA酶。

5.3.13 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCI)溶液，1 mol/L, pH值为8.0：在800 mL去离子水中溶解121.1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

5.3.14 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液，0.5 mo1/L：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)，加入700 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0，用水定容到1L，分装后高压灭菌。

5.3.15 引物和探针：饲料中禽源性成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列见表1。

表1 饲料中禽源性成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列

5.4 检测步骤

5.4.1 待检样品的制备

所有制备样品使用的器具在使用前应充分清洗或使用一次性用品，可经过121℃、 30 min高压灭菌。采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。

5.4.2DNA提取和纯化

DA提取和纯化过程应设置核酸提取空白对照。提取和纯化后的DNA溶液长期保存应贮存-20℃或低于-20℃。

5.4.3CTAB法制备非油脂类饲料模板DNA

称取100 mg粉碎后的样品于1.5 mL、离心管中，加入300uL，冰上预冷的CTAB提取缓冲液I，加入500 pL于65℃预热的CTAB提取缓冲液u，混匀，65℃保温30 min～90 min，其间不时轻缓颠倒混匀；加入5 uL～25uL蛋白酶K，上下倒转混匀，37℃水浴中保温1h，中途每隔10min左右倒转混合数次；待冷却至室温后加入5 uL RNase A溶液(10mg/mL)，室温下放置30 min；室温12000r/min,离心10 min，取上清液，于另一干净的2 mL离心管中，分别用等体积Tris饱和苯酚、Tris饱和苯酚＋三氯甲烷(1+1)和三氯甲烷+异戊醇(24+1)抽提三次，12000r/min，离心10 min；将上清液转移至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇及1/10体积的3 moL/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀；12000r/min，离心10 min，弃上清液，用500 mL 75％乙醇洗涤沉淀两次；一除去残留的乙醇，干燥后，DNA沉淀溶解于100 uL TE缓冲液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用(或进行2％～3％琼脂糖凝胶电泳检测)。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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