6 仪器设备

6.1 研钵或电动研磨器。

6.2 恒温水浴锅或干式恒温器：恒温范围为室温～100℃，精度为±0.5℃。

6.3 电子天平：感量为0.001g与0.0001g。

6.4 台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。

6.5 高温干燥箱。

6.6 冷冻、冷藏冰箱。

6.7 制冰机。

6.8 旋涡振荡器。

6.9 高压灭菌锅。

6.10pH计：

6.11 微量移液器：沐积范围为0.20uL～2.0uL、2uL～20uL、20uL～200uL、200uL～1000uL，枪头用前应高压灭菌处理。

6.12 DNA浓缩仪。

6.13 核酸蛋白分析仪。

6.14 纯水机。

6.15 PCR超净工作台或生物安全柜。

6.16 PCR仪。

6.17 微波炉。

6.18 电泳仪。

6.19 电泳槽。

6.20 凝胶分析成像系统。

7 测定方法

7.1 DNA的抽提及浓度测定

7.1.1 DNA的提取

称取约50 g烘干后的食用菌样品，经干热灭菌(150℃于热处理2 h)或120℃、30 min高压消毒处理的研钵或在粉碎机中研磨成颗粒大小约0.5 mm左右的粉末，备用。称取100 mg烘干后研磨成粉的样品于1.5 mL的离心管中，加600uL～2％ CTAB缓冲液，5 uL蛋白酶K(20 mg/mL), 5 uL Rnase A(10 ug/mL)，剧烈振荡30 s以上，65℃温浴1h，期间定期振荡。加600 uL水饱和酚，三氯甲烷，异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡，1.2×10⁴g离心15 min。取上清液，再加等体积的水饱和酚:三氯甲烷:异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，1.2×10⁴g离心15 min。取上清液，加0.8倍体积异丙醇，混匀，1.2×104g离心10 min。取沉淀，加入400 uL氯化钠(1 mol/L)于65℃温浴中溶解，加等体积的水饱和酚:三氯甲烷:异戊醇(25:24:1)，振荡，1.2×10⁴g离心15 min。取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻微振荡，1.2×104g离心10 min。取沉淀,70％乙醇清洗2次，干燥，加100 uL TE(pH8.0)溶解。每个样品设2个重复。也可使用市售的应用于真菌DNA提取的试剂盒。

7.1.2 DNA的浓度与纯度测定

7.1.2.1 方法1

样品DNA用核酸蛋白分析仪测定260 nm和280 nm处吸收值，分别计算DNA纯度与浓度，DNA纯度等于OD₂₆₀/OD₂₈₀，比值在1.7～2.0之间较为理想。双链DNA浓度(ug/mL)等于50倍OD₂₆₀值。

7.1.2.2 方法2

通过真核生物共有的核糖体18SrDNA基因的PCR扩增结果，判定从样品中提取的DNA是否适合于PCR检测，PCR测试步骤按7.2规定的方法。

7.2 定性PCR检测

7.2.1PCR反应体系

检测食用菌中的内源18SrDNA基因与外源基因采用的PCR检测体系见表2。每个样品反应体系设2个重复(同时做2管)。

表2 定性PCR检测参考反应体系

7.2.2 PCR反应体系对照的设置

进行PCR检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。

阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的DNA。

阴性对照：非转基因食用菌中提取的DNA。

空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。

7.2.3PCR反应热循环参数的设置

94℃预变性2 min, 94℃变性30 s, 54℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 40个循环。72℃延伸5 min。4℃下保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应热循环参数做相应的调整。

7.2.4PCR扩增产物的电泳检测

用0.5×TPE电泳缓冲液制备2％的琼脂糖凝胶。将8uL～10uL的PCR扩增产物分别与1uL～2uL的6×加样缓冲液(电泳前沿指示剂)混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子量大小适当的DNA Marker做分子量标记。选择合适的电压(3V/cm～5V/cm)，电泳时间为50 min～60min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录万分析。

8 结果判断

8.1 样品DNA抽提质量判断

按照真核生物共有的核糖体18SrDNA基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的DNA提取液进行PCR扩增。均应扩增出137 bp的片段，否则，说明提取的DNA质量有问题，或者是DNA溶液中存在PCR反应的抑制因子，应该重新纯化或提取DNA，直至扩增出该DNA片段，防止检测中产生假阴性结果。

8.2 外源基因的检测

如果阴性对照与空白对照未扩增出DNA片段，阳性对照扩出预期的DNA片段，待测样品未扩增出预期的DNA片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的DNA片段，则可初步判定待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。

8.3 结果确证实验与结果表述

8.3.1 方法1实时荧光PCR检测方法

待测样品外源基因PCR扩增阳性结果的，按照SN/T 1204中规定的方法执行。

8.3.2 方法2PCR扩增产物的DNA测序方法

外源基因PCR扩增阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与已知的该外源基因相应序列进行比对加以确证。

注：可根据实验室条件任选一种方法进行确证。

8.3.3 结果表述

经8.3.1或8.3.2确证为阳性的，表述为：检出xxxx基因；确证为阴性的，表述为：未检出xxxx基因。

9 样品保存

9.1 保存条件

干燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于-20℃下。

9.2 保存期限

保存期限为3个月。

相关链接：主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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