三、杂交反应和结果检测

(一)杂交反应

基因芯片检测靶基因片段是基于探针与靶基因核酸的选择性杂交反应。探针固定在片基上，靶基因片段通过流路或加样至芯片上。芯片杂交属于固一液相杂交。影响杂交反应的条件包括靶标浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度、温度及洗涤条件等。严格控制反应条件是保证检测结果准确性和重现性的重要因素。

1．杂交双方浓度的影响

有研究表明，当杂交混合物中靶标浓度约10倍于互补分子时，杂交反应呈现假一级反应动力学规律。此时杂交速率主要决定于探针浓度，杂交信号与探针浓度成正比。这一现象有利于消除或减轻由于芯片制作中各单元点靶标浓度的不平衡和不准确带来的误差，对于平行分析及结果归一化处理尤为重要。因此，在芯片制作和实际应用中，常常使固定的靶标浓度远高于探针浓度，必要时可适当稀释样品。

2．离子浓度的影响

一价阳离子如钠离子的存在可以提高异源杂交双链生成的速度。其原理是钠离子可掩蔽带负电磷酸根骨架，从而影响探针与靶标之间碱基配对的相互作用。通常在芯片杂交时应用的Na+浓度为1mol／L。杂交液中最佳的离子浓度需要通过试验来选择，并在平行检测中保持一致。

3．杂交温度的影响

一般来讲，杂交所需的温度由探针的长度和序列组成(G+C含量)决定，长度越长，所需温度越高。原位合成基因芯片的杂交温度通常为25～42℃。机械点样基因芯片的杂交温度通常为55～70℃。最佳的杂交温度需通过试验确定。

4．探针与靶基因片段序列组成的影响

杂交的第一步是两条DNA单链随机碰撞形成局部双链，但形成的局部双链是不稳定的，如果此局部双链周围的碱基不能配对，则局部双链很快重新解离。继续随机碰撞，一旦找到正确的互补区，则首先形成的局部双链就形成核。核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。第一步的成核反应是整个杂交过程的限速步骤。探针链越长，其形成完整的双链分子所需的时问就越长。序列组成对成核反应的影响很大。G—C问形成3个氢键，而A—T间形成2个氢键，所以富GC区杂交双链的稳定性较好。当这些稳定区长度达到约50个碱基时，可以产生“成核”区，探针与靶基因片段的双链由此延伸。因此不同的G+C含量对杂交反应影响很大。DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数越少，互补序列的浓度就越低，形成完整的双链分子所需的时间就越长。由于同一芯片中各种探针的长度和组成不同，加上探针与靶基因片段序列组成的影响比较复杂，因此选择的反应条件应尽可能兼顾全面，保证各类特异性杂交体的形成，减少非特异性杂交体的形成。

5．洗涤

杂交后的芯片要经过严格的洗涤，去除未杂交的或部分产生了非特异性结合的样品，降低检测的背景。清洗的方法有很多种，用得较多的是化学清洗法。目前采用的电清洗法，利用了非特异性结合的分子之问由于氢键的不配对而导致的结合力减弱，可以使一个碱基不匹配的两分子分开。

(二)芯片扫描和检测

1．原理

在样品靶基因扩增过程中带荧光素分子标记的单核苷酸随机掺入到其序列中，当其与芯片上固定的探针发生特异性杂交而结合在芯片的不同位点上时，荧光素分子受特定波长的激发光的照射而发射出特定波长的荧光。完全杂交则信号较强，不完全杂交则信号较弱，不杂交则无信号。通过扫描和检测，结合芯片上各点的设计和分布信息，可分析和检出样品中与靶基因相关的各种信息。在目前的技术条件下，基因芯片检测主要以定性分析或半定量分析为主，准确的定量分析，尤其是样品含量的定量分析技术尚不成熟。

2．激光共聚焦芯片扫描仪

激光以其单色性好、光强度高而区别于其他光源。以激光作激发光源，可以产生较高强度的发射荧光，具有较高的检测灵敏度；激光经聚焦后，可以产生极小和精细的光斑，扫描检测具有极高的分辨率，可满足高密度芯片扫描检测的需要。目前此类仪器多采用2种或2种以上不同波长的激光器作为激发光源，以激发不同荧光染料标记的靶分子，实现在一块芯片上对多种不同类型靶分子的检测和分析。通过荧光光密度比来减少或消除测定时某些干扰引起的实验误差，提高实验的可靠性，采用有较宽光电响应动态范围的光电倍增管作为光电耦合器件对弱光信号进行检测，对接收的荧光信号进行多级放大，极大地提高了检测灵敏度，可检测小于每平方微米1个荧光分子，能较好地满足对芯片荧光斑点检测的要求。这种检测方法灵敏度和分辨率很高，能获取高质量的图像和数据，但扫描时间较长，比较适合大规模生物芯片杂交信号的检测，可广泛应用于基因诊断、基因表达等方面研究。常用的激光器有氩离子激光器、氩氪离子激光器、氦氖激光器和固态激光器。激发光波长从488nm至近红外区。

激光共聚焦芯片扫描仪带有的数据分析软件可以对检测结果进行处理，如斑点面积、荧光强度的计算，背景测定及扣除，不同光源检测结果的比对、叠加和运算，结果的存储，并具有按照检测得到的结果上网自动搜索及分析靶基因相关信息的功能。

3．荧光显微摄像芯片扫描仪

利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下具有不同的吸收和发射光，在微阵列分析中，多色荧光标记可以在一个分析中同时对两个或多个生物样品进行多重分析，多重分析能大大增加基因表达和突变检测结果的准确性，排除芯片与芯片间的人为因素，再利用显微摄像技术获得所需数据。荧光显微摄像芯片扫描仪多采用氙灯或高压汞灯作激发光源，以干涉滤光片为单色器，以摄像机为信号接收和检测系统，以计算机作信号存储和处理系统，一次能读取一个激发光波长下的图像。对于多个染料标记的芯片，需通过单色器更换激发光波长，分次读取信号。

荧光显微摄像芯片扫描仪由于其分辨率较低(受光源、单色器及摄像系统的限制)，不能适应高密度芯片的检测需要，但仍可适用于中、低密度芯片的检测，且还有仪器价格较低、扫描速度较快的长处。