一、测定原理(纸色谱法)

日落黄在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。

二、实训操作

1．仪器设备

G₃垂融漏斗；真空泵；水浴锅；研钵；干燥箱；微量注射器或血色素吸管；滤纸：中速滤纸，纸色谱用；电吹风机；剪刀；漏斗；蒸发皿；可见分光光度计；5mL容量瓶；10mL比色管。

2．试剂

①聚酰胺粉(尼龙6)：200目；硅胶G；乙醇(50％)；可溶性淀粉；柠檬酸溶液(200g／L)；

②乙醇一氨溶液：取1mL氨水，加乙醇(70％)至100mL。

③pH6的水：用柠檬酸溶液(20％)调节至pH6。

④展开剂：正丁醇一无水乙醇一氨水(1％)(6+2+3)：供纸色谱用。

⑤展开剂：正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)：供纸色谱用。

⑥日落黄标准溶液：准确称取按浓度折算为100％质量的日落黄0.100g置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶液(1.00mg／mL)。

⑦日落黄标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释到刻度，此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。

3．色素提取

称取5.00g粉碎的去核蜜饯→加30mL水→温热溶解→pH试纸测pH→若高，用柠檬酸溶液(200g／L)调至pH4左右。

4．吸附分离

将处理后所得的溶液加热至70℃→加入0.5～1.0g聚酰胺粉→充分搅拌→柠檬酸溶液(200g／L)调pH至4→着色剂完全被吸附→将吸附日落黄的聚酰胺全部转入
G3垂融漏斗→过滤(抽滤)→用pH4的70℃水反复洗涤，每次20mL→边洗边搅拌→若含有天然着色剂，用甲醇-甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL→至洗液无色为止→
用70℃水多次洗涤(洗涤过程中应充分搅拌)叶至流出的溶液为中性→乙醇-氨溶液分次解吸日落黄着色剂→收集全部解吸液→水浴上驱氨。

5．测定

(1)分离测定

①单色色谱：甩水准确稀释至50mL→用分光光度法进行测定。

②多种着色剂混合液：将上述溶液置水浴上浓缩至2mL→移人5mL容量瓶→用50％乙醇洗涤容器→洗液并人容量瓶中并稀释至刻度→纸色谱或薄层色谱法分离后
测定。

(2)定性分析 色谱用纸→在距底边2cm的起始线上分别点3～1μL试样和l-2μL日落黄标准溶液→挂于分别盛有正丁醇-无水乙醚-氨水(1％)(6+2+3)、正丁醇一吡啶一氨水(1％)(6+3+4)的展开剂的层析缸中→上行法展开→待溶剂前沿展至15cm处将→滤纸取出于空气中晾干→标准斑比较定性。

也可取.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。

(3)定量测定

①试样制备：将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。

②标准曲线制备：分别吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL日落黄色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。

③比色定量：上述试样与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，与482nm下测定吸光度，分别绘制标准曲线比较。