酶联免疫法(ELISA法)测定食品中的黄曲霉毒素B1

1．原理

样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。

2．试剂

①抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、人工抗原(AFB1-牛血清白蛋白结合物)、三氯甲烷、
甲醇、石油醚、牛血清白蛋白(BSA)、邻苯二胺(OPD)、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、过氧化氢(H2O2)、硫酸。

②黄曲霉毒素B1标准溶液：用甲醇将黄曲霉毒素B1配制成lmg／mL溶液，再用甲醇～PBS溶液(20+80)稀释至约10μg／mL，紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的光密度值，

代入式(10—5)计算：
A×M×1000×f
X＝一一一一一一一一
ε

式中，X为该溶液中黄曲霉毒素B·的浓度，,ug／mL；A为测得的光密度值；M为黄曲霉毒素B1的相对分子质量312；ε为摩尔吸光系数，21800；f为使用仪器的校正因素。

根据计算将该溶液配制成10μg／mL标准溶液，检测时，用甲醇-PBS溶液将该标准溶液稀释至所需浓度。

③ELISA缓冲液。

a．包被缓冲液(pH9．6碳酸盐缓冲液)的制备：1．59g Na2CO3与2.93g NaHCO3用蒸馏水溶解，定容至1000mL。

b．磷酸盐缓冲液(pH7．4 PBS)的制备：0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4、12H2O、8.0g NaCL加0.2g KCl，用蒸馏水溶解，定容至1000mL。

c．洗液(PBS-T)的制备：PBS加0．05％(体积分数)Tween-20。

d．抗体稀释液的制备：BSA 1.0g加PBS-T至1000mL。

e．底物缓冲液的制备。A液(0.1mol／L柠檬酸水溶液)：柠檬酸(C6H8O7.H2O)2.01g，加蒸馏水至1000mL。B液(0.2mol／L磷酸氢二钠水溶液)：Na2 HPO4.12H2O71.6g，加蒸馏水至1000mL。用前按A液+B液十蒸馏水为24．3+25．7+50的比例(体积比)配制。

f．封闭液的制备：同抗体稀释液。

3．仪器

小型粉碎机、电动振荡器、酶标仪(内置490nto滤光片)、恒温水浴锅、恒温培养箱、酶标微孔板、微量加样器及配套吸头。

4．分析步骤

(1)取样取样方法与薄层色谱法测定食品中的黄曲霉毒素B1的方法相同。

(2)提取

①大米和小米(脂肪含量小于3.0％)的提取 试样粉碎后过20日筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150r／min振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中。立即取12mL滤液(相当于4.0g样品)于75mL蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。用2.0mI20％甲醇-PBS分3次(0.8mL、0.7mL、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液lmL相当于2.0g样品。

②玉米的提取(脂肪含量3．0％～5．0％) 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中，准确加入50.0mL甲醇一水(80+20)溶液和15.0mL石油醚·盖塞后滴水封严。150r／min振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。待分层后，放出下层甲醇一水溶液于50mL烧杯中，从中取10.0mL(相当于4.0g样品)于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL 20％甲醇-PBS分3次(0．8mL、0．7mL、0．5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液lmL相当于2.0g样品。

③花生的提取(脂肪含量15．0％～45．0％) 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇水溶液(55+45)和30mL石油醚。盖塞后滴水封严。150r／min振荡30min。静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。

待分层后，放出下层甲醇水溶液于l00mL烧杯中，从中取20.0mL(相当于4.0g样品)置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层)。放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中。再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷一并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。用2.0mL 20％甲醇-PBS分3次(0.8mL、0.7mL、0.5mL)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液lmL相当于2.0g样品。

④植物油的提取用小烧杯称取4．0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇水溶液(55+45)分次洗烧杯，溶液一并移于分液漏斗中(精炼油4.0g样为4．525mL，直接用移液器加入分液漏斗，再加溶剂后振摇)，振摇2min。静置分层后放出下层甲醇水溶液于75mL蒸发皿中，再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。用2.0mL20 %甲醇-PBS分3次(0.8mL、0．7mL、0．5mI。)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液1mL相当于2.0g样品。