该方法适用于玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁)、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。

样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和色谱净化高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1以及黄曲霉毒素Bl、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素Gl、黄曲霉毒素G2总量检出限为1μg／kg。

1．原理

试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和色谱净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在色谱分离介质中抗体上。用水或Tween-20／PBS将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇通过免疫亲和色谱柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。

2．试剂和溶液

甲醇(色谱纯)、甲醇一水(7+3)(取70mL甲醇加30mL水)、甲醇一水(8+2)(取80mL甲醇加20mL水)、甲醇-水(45+55)(取45mL甲醇加55mL水)、苯(色谱纯)、乙睛(色谱纯)、苯-乙腈(98+2)(取2mL乙腈加98mL苯)、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾。

PBS缓冲液：称取8.0g氯化钠，1．2g磷酸氢二钠，0．2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。

Tween-20／PBS溶液(0．1％)：取1mL Tween-20，加入PBS缓冲液并定容至1000mL。

pH7.0磷酸盐缓冲液：取25.0mL 0.2mol／L的磷酸二氢钾溶液与29．1mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液混匀后，稀释到100mL。

黄曲霉毒素标准品(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素 G2)：纯度大于99％。

黄曲霉毒素标准储备溶液：用苯-乙腈(98+2)溶液分别配制0.100mg／mL的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准储备溶液。保存于4℃备用。

黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准储备溶液，用苯一乙腈(98+2)溶液稀释成混合标准工作液。

柱后衍生溶液(0.05％碘溶液)：称取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加纯水定容至 200mL，以0．45μm的尼龙滤膜过滤，4℃避光保存。

3．仪器和设备

高速均质器(18000～22000r／min)、黄曲霉毒素免疫亲和柱、玻璃纤维滤纸(直径11cm，孔径1．5μm)、玻璃注射器(10mL、20mL)、玻璃试管(直径12mm，长75mm，无荧光特性)、高效液相色谱仪(具有360nm激发波长和大于420nm发射波长的荧光检测器)、空气压力泵、微量注射器(100gL)、色谱柱(C18柱，柱长150mm，内径4．6mm，填 料直径5μm)。

4．分析步骤

(1)提取大米、玉米、小麦、花生及其制品：准确称取经过磨细(粒度小于2mm)的试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及甲醇-水(7+3)至125.0mL (V1)，以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15．0mL(V2)滤液并加入30．0mL(V3)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清，备用。

植物油脂：准确称取试样25.0g于250mL。具塞锥形瓶中，加入5．0g氯化钠及加入甲醇一水(7+3)至125.0mL(Ⅵ)，以均质器高速搅拌提取2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL (V2)滤液并加入30.0mL(％)水稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1～2次，至滤液澄清备用。

(2)净化将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL(眠)样品 提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL／min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体。以10mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过柱体。准确加入1．0mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速 为1～2mL／min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

(3)测定 高效液相色谱条件：流动相为甲醇-水(45+55)，流速0.8mL／min；柱后 衍生化系统；衍生溶液为0.05％碘溶液，衍生溶液流速0.2mL／min；反应管温度70℃；反应时间1min。

用进样器吸取100μL黄曲霉毒素混合标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值(峰高或峰面积)，得到黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标准溶液高效液相色谱图。

取样品洗脱液1.0mL加入重蒸馏水定容至2.0mL，用进样器吸取100μL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值(峰高或峰面积)。经过与黄曲霉毒素标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的浓度c。

(4)空白试验用水代替试样，按相同步骤做空白试验。